1. Создание генетической карты генома

Точную генетическую карту можно было создать при вы­полнении двух условий: обнаружении в геноме большого ко­личества полиморфных генетических маркеров и наличия до­статочного количества семей для анализа сцепления между этими маркерами и установления их взаимного расположе­ния. Проблема генетических маркеров была разрешена после обнаружения различных типов ДНК-полиморфизмов. В по­рядке их введения в генетический анализ первым был обна­ружен полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ), затем полиморфизм, обусловленный варьирующим числом тандемных повторов (VNTR-полиморфизм), следую­щим — полиморфизм мини-сателлитов, после него полимор­физм микросателлитов, в последнее время особенное распро­странение получил однонуклеотидный полиморфизм. Все пе­речисленные виды полиморфных маркеров обнаруживают менделевское кодоминантное наследование. Каждый из этих видов имеет свои преимущества и недостатки, но все вместе они позволяют маркировать геном человека с очень высокой плотностью.

Даже первые 4 типа полиморфизмов позволили создать ге­нетическую картину генома человека, в которой маркеры располагались друг от друга на среднем расстоянии менее 1 сМ или менее 1 млн п.н. Установить взаимное расположе­ние маркеров позволила коллекция, или банк иммортализо- ванных линий клеток, полученных от всех членов нескольких сотен семей, которые включали не менее трех поколений. Этот банк клеточных линий был создан во Франции для изу­чения полиморфизма в системе HLA и очень пригодился для генетического картирования генома человека. После того как в каждой хромосоме было картировано и установлено взаим­ное расположение 10—15 полиморфных маркеров, работа с последующими маркерами очень упрощалась, так как вся ра­бота проводилась на одних и тех же семьях (точнее на мате­риале, полученном от членов этих семей).

2. Создание физической карты генома

Для того чтобы создать физическую карту генома, клони­рованные фрагменты генома человека также необходимо было маркировать. Это было сделано с помощью коротких сиквенсов в 100—200 п.н. концов фрагментов (последовате­льность из 18—20 нуклеотидов уже является уникальной для генома), так называемых STS (sequence tagged sites), хромо­сомная локализация которых точно известна. STS легко идентифицируются с помощью ПЦР. Получено более 50 000

3 И

К

Фрагменты ДНК из геномной библиотеки, меченные STS (А-К)

	в	г д -•	—-»■
Б	в	д	Е # 9	3 И К 9
-• •» А Б			ЕЖ	3

• ♦

ЕЖ

• • •

В. Г д

Б -В •

Расстановка фрагментов ДНК в последовательности, которая задается метками STS

Рис. 7.6. Использование STS как маркеров перекрывания фрагмен­тов ДНК при построении физической карты.

Вверху показаны фрагменты ДНК из геномной библиотеки, в которых най­дены специфические STS, внизу — взаимное расположение фрагментов ДНК, определенное по расположению STS,

STS, разбросанных по геному, и во время физического кар­тирования, когда устанавливается взаимное расположение ДНК фрагментов из геномных библиотек, эти STS использу­ют как маркеры перекрывающихся сегментов ДНК (рис. 7.6). Из рис. 7.6 видно, что из перекрывающихся фрагментов ДНК, которые до этого могли быть клонированы в составе бактериальных, фаговых или дрожжевых искусственных хро­мосом, можно построить достаточно протяженные отрезки ДНК. Последние называют контигами. В свою очередь из контигов можно построить физическую карту хромосомы.

3. Сиквенс генома человека

Далее мы кратко остановимся на основных результатах «чернового» сиквенса генома человека, которые, как уже ука­зывалось, были опубликованы в февральском номере журна­ла «Nature» за 2001 г. Они представляют собой результат дея­тельности международного консорциума по сиквенсу генома человека, в который вошли 20 исследовательских групп из США, Великобритании, Японии, Франции, Германии и Ки­тая.

Понятие «черновой вариант» прежде всего относится к тому факту, что сиквенс не непрерывен — в нем имеются бреши. Поскольку таких брешей достаточно много, то невоз­можно расположить по порядку и ориентировать многие мел­кие секвенированные последовательности. Неполнота сик­венса, естественно, пока создает проблемы для идентифика­

ции генов наследственных болезней, уникальных генов и других генетических структур.

Следует отметить, что за последнюю четверть XX в. были секвенированы геномы 599 вирусов и вироидов, 205 плазмид, 185 органелл, 31 эубактерии, 1 вида грибов, 2 видов живот- ных и несколько других геномов. Опыт, накопленный в резу­льтате этой работы, был в полной мере использован при сек- венировании генома человека.

Стратегия сиквенса генома человека в общественном про­екте включала в себя получение генетической и физической карты генома человека, последующее введение в эти карты результатов сиквенса отдельных клонов геномной ДНК (стратегия сиквенса «клона за клоном»). Такой подход, по мнению организаторов программы, позволяет избежать оши­бок в сиквенсе, особенно в областях повторов. Физическая карта человеческого генома имеет клональную основу, которая была разработана Olson еще в 1981 г. Подход заключается в следующем. Геном разрезался на сегменты, содержащие по 150 ООО п.н., с помощью частичного переваривания сайтспе- цифическими эндонуклеазами. Эти большие сегменты ДНК помещали в искусственные бактериальные хромосомы (ВАС) и вводили в бактерии, где они копировались при каждом де­лении бактерии. В результате образовались клоны идентич­ных молекул ДНК. Таких клонов, перекрывающих геном че­ловека, должно быть примерно 20 ООО. Каждый клон полно­стью переваривался рестрикционной эндонуклеазой, ото­бранной для получения характерного паттерна малых фраг­ментов, или фингерпринта клона. Сравнение паттернов сай­тов рестрикции позволяло обнаружить перекрывание между клонами, что дало возможность установить их взаимное рас­положение и выстроить по порядку. Кроме того, для установ­ления порядка клонов использовали ранее разработанные карты STS (см. выше). В результате получилась физическая карта генома. Отдельные ВАС-клоны разрезались на фраг­менты и клонировались. Полученные в результате клониро­вания фрагментов субклоны секвенировали. Каждый раз сек- венировали большое число одинаковых субклонов, чтобы быть уверенным в том, что каждый фрагмент оригинального ВАС-клона проанализирован несколько раз и при этом не допущено ошибок. Сиквенсы отдельных фрагментов объеди­няли с тем, чтобы получить последовательность нуклеотидов в каждом исходном ВАС-клоне. Наконец, сиквенс всего ге­нома собирали путем соединения сиквенсов набора ВАС, пе­рекрывающих весь геном. Созданная таким образом карта сиквенса генома человека имеет более 1000 разрывов. Это может быть связано с рядом причин, в частности с тем, что исходные ВАС-клоны не перекрывали весь геном, а также перекрывание между клонами было пропущено из-за присут­ствия крупных повторов в геноме. Созданная в результате ре­ализации проекта карта сиквенса включает последовательно­сти, содержащие в среднем несколько миллионов пар нукле­отидов в длину. Сегменты такой длины достаточны, чтобы карту, основанную на клонах, наложить на другие карты с меньшим разрешением. Для этого была использована FISH- гибридизация in situ ВАС-клонов. Положение на генетиче­ской карте секвенированных последовательностей определя­ли также относительно картированных STS. Таким путем секвенированные сегменты были расположены в определен­ном порядке и ориентированы в виде прерывистых пятен на генетической и цитогенетической картах, которые можно найти в интернете на сайтах http://www.ncbi.nlm.nih.gov/; http://www.gdb.org/hugo/; http://www.ensembl.otd/genome/cen- tral.

В общем секвенировано и собрано с помощью компьютер­ных программ в протяженные участки около 90 % эухромати- новых районов генома. Законченным, однако, можно считать сиквенс только для приблизительно ^ генома, в котором каждая пара оснований секвенирована в среднем 8—10 раз (предполагают, что такое количество повторов сиквенса каж­дого нуклеотида будет достигнуто в окончательном сиквенсе для всего генома человека). Несмотря на неполноту сиквен­са, целый ряд полученных с его помощью результатов уже сейчас представляет несомненный интерес. Это относится в первую очередь к углублению наших глобальных представле­ний об организации генома человека.