14. Основные подходы к получению библиотек днк прокариотических и эукариотических организмов

Ответ. Часто для выделения необходимого гена используют банк генов. Банк генов, или клонотека (геномная библиотека) – это коллекция клонов ДНК, включающая все фрагменты, входящие в состав генома данного вида. Для ее создания необходимо выделение всей (тотальной) геномной ДНК, ее фрагментация с помощью рестриктаз или методом дробовика (ультразвуком); присоединение полученных фрагментов к клонирующим векторным молекулам, введение рекомбинантных ДНК в реципиентные бактерии для их последующего клонирования. В результате получают клоны с разными фрагментами одной молекулы ДНК. Набор клонированных фрагментов генома и называется банком генов, а точнее, – это произвольная (случайная) коллекция клонированных фрагментов ДНК, представляющая собой совокупность всех нуклеотидных последовательностей ДНК данного индивида или вида. Однажды полученная, библиотека генов может храниться и использоваться неограниченно долго. В библиотеке содержится вся наследственная информация организма. Банк генов – это не только источник для получения нужного трансгена, но и источник материала для изучения структуры, функции и регуляции индивидуальных генов, структуры и функции белков. С его помощью можно также решить проблему сохранения генофонда исчезающих видов. Хромосомные библиотеки. Величина генома человека очень большая и необходимы сотни тысяч клонов для представления всего генома. С целью облегчения работы сконструированы библиотеки каждой хромосомы. У человека созданы 24 хромосомные библиотеки (для каждой хромосомы). Если известно, в какой хромосоме локализован ген, то исследоваться будет библиотека клоновданной хромосомы. Выделение отдельных хромосом возможно из-за отличия их по размерам и по строению. Они разделяются методом проточной цитометрии. Библиотеки кДНК. Набор клонов, полученных на основе комплементарной ДНК, называется библиотекой кДНК. Будучи синтезированной на основе мРНК, кДНК соответствует только активным транскрибируемым генам, которые специфичны для данной клетки, ткани. Клонируется кДНК в фаговых или плазмидных векторах. Однако в отличие от фрагментов полученных путем рестрикции, молекулы кДНК не содержат липких концов и для введения их в вектор к этим фрагмен-там ''пришиваются'' адапторы с липкими концами. Первый банк генов был создан для клеток E. Coli. Бактериальную ДНК авторы фрагментировали гидродинамическим способом, а встраивание фрагментов осуществляли через АТ-коннектор. Этот метод фрагментации ДНК обеспечивает статистически равномерное распределение точек разрывов по молекулам ДНК и позволяет регулировать средний размер фрагментов. Для составления представительной геномной библиотеки необходимо собрать большое число клонов, достигающее для высших эукариот нескольких сотен тысяч и даже миллионов. В системах клонирования, предназначенных для конструирования таких библиотек, серьезное внимание уделяется проблеме прямой селекции подобных клонов. Ни один из методов не абсолютен. По этой причине стараются поставить, как минимум два барьера против клонов, не содержащих рекДНК. Одним из таких барьеров служит ограничение размера ДНК при ее упаковке в фаговые головки. Поэтому часто применяют векторы, сконструированные на базе ДНК фагов лямбда и P1. Хотя построение библиотек и их скрининг остаются важными методами для обнаружения и описания свойств генов, проект «Геном человека» и множество его приложений имеют значительное влияние на исследования генетики человека. Например, быстрое расширение доступных через Интернет баз данных, содержащих информацию о нуклеотидных последовательностях генов, делает все более необязательным построение и скрининг библиотек. Доступны для общего использования огромное количество ВАС и полных библиотек кДНК человека и других видов, а полная последовательность множества индивидуальных ВАС и кДНК клонов этих библиотек уже депонируется в доступных базах данных. ВАС или к ДНК клоны с конкретной интересующей последовательностью нуклеотидов могут быть идентифицированы с помощью программного обеспечения, которое сопоставляет искомую последовательность со всеми загруженными в базы данных последовательностями. Многие актуальные библиотеки, содержащие упорядоченные последовательности отдельных клонов, хранятся в централизованных коммерческих хранилищах, из которых легко может быть получен любой клон с интересующей последовательностью, найденный автоматизированным поиском по базе данных.