25. Методы секвенирования днк

Ответ. Секвенирование ДНК по Сэнгеру: "плюс-минус" метод. Для получения копии исследуемого полинуклеотида в последнем выбирают точку отсчета, что достигается введением в систему ферментативного синтеза в качестве нуклеозидного компонента олигонуклеотида-затравки. Такой олигонуклеотид во всех копиях, образующихся в результате достраивания его ферментативным путем, остается постоянным 5'-концевым фрагментом, т. е. является точкой отсчета. Копирование с помощью ДНК- полимеразы в присутствии всех четырех дезоксирибонуклеозид-5'- пирофосфатов (один из них берется 32Р-меченным) проводят в течение ограниченного времени. Цель этого этапа - проведение статистически ограниченного синтеза для получения всех возможных копий, начиная с затравки, достроенной на одно, два и т. д. звеньев, и включая полную копию изучаемого полинуклеотида. В идеале смесь должна включать все возможные полинуклеотиды, синтез которых статистически прекращается где-то в середине матричного полинуклеотида в районе ATGCTG матричной последовательности. На практике различные компоненты смеси присутствуют в разных количествах. Если такую смесь далее подвергнуть электрофорезу в полиакриламидном геле в определенных условиях, когда скорость движения пропорциональна длине цепи, на электрофореграмме обнаруживается серия полос, представляющих различные олигонуклеотиды. Такое фракционирование обычно не проводят, хотя оно может использоваться для контроля на завершающем этапе анализа. Инкубационную смесь 32Р-меченных олигонуклеотидов различной длины в виде комплексов с матричным полинуклеотидом подвергают гель-фильтрации для удаления дезоксирибонуклеозид-5'- трифосфатов и аликвоты реакционной смеси реинкубируют с ДНК- полимеразой в различных условиях. В случае "минус-системы" реинкубацию проводят в присутствии только трех дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфатов. Например, в «- А-системе» отсутствует dATP и каждая копия в смеси достраивается с помощью ДНК-полимеразы до места, в котором следующим мономерным звеном должен быть остаток pdA (т.е. Т в матричном полинуклеотиде). Образующуюся смесь фракционируют с помощью электрофореза и обнаруживают (ауторадиографически) ограниченное количество полос (их количество равно количеству Т в матричном полинуклеотиде). Аналогично проводят копирование в отсутствие других субстратов: - dGTP, - dCTP или - dTTP (- G-,- С- и - Т-системы соответственно). Все четыре ионофореза проводят в полиакриламидном геле параллельно. Полученные ауторадиограммы позволяют сразу написать нуклеотидную последовательность, причем чтение цепи снизу вверх соответствует 5' 3'-полярности цепи копии. Например, положение самого короткого олигонуклеотида (в " - Т-системе") указывает на то, что следующий за ним по длине олигонуклеотид заканчивается на Т, т.е. что против полосы, расположенной выше (это полоса в - А-системе), следует записать букву Т. Таким же образом записывают далее в последовательности А (на основании положения следующего по длине олигонуклеотида, который оказался в "- А-системе") и т. д. Соответствующий участок цепи в матрице читается с учетом принципа комплементарности и антипараллельности цепей в комплексе матрица - затравка. Для проверки этих данных используют результаты анализа с помощью "плюс-системы". В этом случае дополнительное копирование (после первого этапа) проводят в присутствии ДНК-полимеразы, выделенной из бактериофага Т4, которая в отсутствие субстратов (нуклеозид-5'-трифосфатов) проявляет 3'-экзонуклеазную активность, т. е. отщепляет мононуклеотиды один за другим с 3'-конца. В то же время в присутствии субстратов ее полимеразная активность во много раз превосходит экзонуклеазную. Так, если в реакционной смеси присутствует хотя бы один дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфат (dATP в " +А-системе"), деградация каждой копии, образовавшейся на первой стадии анализа, будет проходить вплоть до места положения А (Т в матрице). В этом случае pdA включается много быстрее, чем удаляется, и, таким образом, накапливаются фрагменты, содержащие на 3'-конце цепи А. Аналогично проводят копирование в присутствии только dGTP, dCTP или dTTP. Смеси параллельно подвергают электрофорезу, как и в предыдущем случае, и получают ауторадиограммы, из которых сразу считывается последовательность 5' 3'-направление (считывается также снизу вверх). Из сравнения фореграмм "плюс-" и "минус-систем" делается однозначный вывод о нуклеотидной последовательности в копиях и, следовательно, в матричном полинуклеотиде. Использование ферментативного синтеза олиго- и поли- дезоксирибо- нуклеотидов для определения первичной структуры ДНК. Первым методом секвенирования, который учѐные сумели применить для обработки целых геномов (в том числе генома человека), стало секвенирование по Сэнгеру. Смысл таков: участок ДНК клонируется, после чего полученная смесь делится на четыре части. Каждая часть помещается в активную среду, где присутствуют. ДНК-полимераза, которая занимается репликацией. Праймеры, необходимые для начала процесса репликации. Смесь всех четырех нуклеотидов, которые будут служить «кирпичиками» для строительства новых копий ДНК. И, главное, специальные вариации одного из нуклеотидов (ровно один вид нуклеотидов для каждой части), которые прекращают дальнейшее копирование молекулы ДНК. Процесс практически идентичен клонированию ДНК. Разница только в том, что теперь в один из нуклеотидов подмешаны «ложные» нуклеотиды; они могут образовать точно такую же водородную связь, но не могут продолжить свою нить дальше. В результате в каждой части образуется большое число копий префиксов исследуемого участка ДНК, которые имеют разную длину, но всегда заканчиваются на одну и ту же букву – в зависимости от того, когда повезѐт взять в процесс клонирования «ложный» нуклеотид. В сумме, в четырех пробирках мы получили все возможные префиксы интересующего нас участка. Это значит, что если мы сможем просто измерить длину каждого префикса (точнее говоря, даже не измерить, а просто упорядочить, узнав, кто из них длиннее), то мы сможем узнать и последовательность тоже. Предположим, что мы увидели, что в пробирках лежат префиксы вот такой длины (по порядку, от самого легкого 1 до самого тяжелого 10). Сэнгеровское секвенирование дает отличные результаты с достаточно длинными ридами (короткие участки ДНК), которые потом относительно легко собирать. Именно при помощи сэнгеровского секвенирования был впервые расшифрован геном человека. Секвенирование по Сэнгеру применяется и сегодня, но его все активнее вытесняют другие методы, и применяется оно все реже. Метод Максама и Гилберта (химический). Один из методов основан на химической деградации ДНК. Он был предложен в 1976 году Максамом и Гилбертом и назван их именем. Суть метода сводится к следующему: один из концов фрагмента ДНК метят с помощью изотопа фосфора 32Р. В последнее время вместо радиоактивной вводят флюоресцирующую метку. Ее можно «цеплять» и к нуклеотидам, причем для каждого типа нуклеотидов подбирать различную окраску. Препарат меченой ДНК делят на четыре порции и каждую из них обрабатывают реагентом, специфически разрушающим одно или два из четырех оснований, причем условия реакции подбирают таким образом, чтобы на каждую молекулу ДНК приходилось лишь несколько повреждений. Первым этапом является модификация определенных нуклеотидов под действием различных химических агентов. Концентрация агента и продолжительность его воздействия на молекулы ДНК подбирается с таким расчетом, чтобы в каждой молекуле произошла модификация только одного нуклеотида, а поскольку в реакционной смеси присутствует огромное количество таких молекул, то все основания данного типа в секвенируемом фрагменте ДНК окажутся модифицированными. Следующий этап – удаления модифицированных оснований и обоих фосфатов, окружающих дезоксирибозу, разрыв цепи. Для каждого типа нуклеотидов или их комбинации проводят отдельные реакции ограниченной модификации и количественного расщепления. Таким образом, в результате четырех (или иногда трех, пяти или даже шести) типов реакций образуется смесь олигонуклеотидных молекул, различающихся по размеру на один нуклеотид и несущих на одном из концов метку, радиоактивную. После разделения продуктов реакции в соседних дорожках полиакриламидного геля будет видна лестница из полос ДНК, "чтение" которой позволяет восстановить последовательность нуклеотидов секвенируемого фрагмента ДНК. В основе автоматического секвенирования лежит метод ферментативного секвенирования с использованием терминирующих ddNTP. Как и классический вариант Сэнгера, автоматическое секвенирование включает две стадии: проведение терминирующих реакций и разделение продуктов этих реакций с помощью электрофореза. Как правило, автоматизирована лишь вторая стадия, т.е. разделение меченных фрагментов ДНК в ПААГ, получение спектра эмиссии флуорофоров и последующий обсчет собранных данных. Таким образом, автоматическое секвенирование идеологически отличается от современного ему ручного секвенирования только типом используемой метки. Флуоресцентную метку включают либо в праймер, либо в терминатор транскрипции согласно следующим схемам: меченный праймер (четыре разных красителя) и немеченые терминаторы; меченный праймер (один краситель) и немеченые терминаторы; меченные терминаторы (каждый тип терминатора своим красителем) и немеченый праймер. Использование меченных праймеров предполагает проведение четырех независимых реакций (отдельно с каждым из терминаторов) для каждого секвенируемого образца. Использование меченных терминаторов позволяет совместить все четыре реакции в одной пробирке. Если используется единственный краситель, то разделение продуктов сиквенсовой реакции в геле проводят на четырех разных дорожках. Использование четырех разных красок позволяет разгонять продукты реакции(й) на одной дорожке. Пиросеквенирование. Итак, берется образец ДНК, которую надо прочитать. Специальные ферменты нарезают его на кусочки случайным образом, и кусочки эти изолируют друг от друга предельным разведением. К каждому кусочку цепляют адапторную нуклеотидную последовательность, которая, в свою очередь, цепляется к маленькой бусинке (средний диаметр – 28 микрометров). К одной бусинке прикрепляется только один фрагмент. Затем бусины попадают в капельки водной эмульсии в масле. В этих капельках содержится все необходимое для амплификации ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Каждая капелька – это отдельный реакционный сосуд, в котором копируется один и только один фрагмент ДНК. После ПЦР к каждой бусинке прицепляется около 10 млн. копий индивидуального фрагмента. Эмульсию разрушают, и бусинки, обросшие ДНК, центрифугированием загоняют в реакционные сосуды – открытые сверху микроскопические соты (диаметр каждой ячейки 44 микрометра, объем – 75 пиколитров). Соты размещены на волоконно-оптической подложке – квадратике размером 6 на 6 см, который несет на себе примерно 1,6 миллиона ячеек. Если бусина попадет не в каждый «колодец», это даже хорошо: меньше будет вероятность ложных сигналов. Теперь поместим пластинку в специальный прибор и будем омывать ее по очереди четырьмя растворами, содержащими нуклеотиды, – Т, С, A, G. Когда очередное основание присоединяется к цепочке, высвобождается пирофосфат и запускает флуоресценцию, поскольку в ячейках, помимо ДНК-полимеразы, присутствуют люцифераза и люциферин. Ферменты, как и ДНК, тоже прицеплены к бусинам, которые не вымываются из ячеек, а остаются на местах, удерживая ферменты и матрицу, нуклеотиды же сменяют друг дружку. Пришел аденин – во всех сотах, где к цепочкам присоединяется А, вспыхивают огоньки, а остальные, ожидающие Т, G или С, остаются темными, пока не настанет их очередь. Оптические волокна передают вспышки на сенсорное устройство, компьютер записывает букву за буквой сразу в сотне тысяч последовательностей. Однонитевые фрагменты ДНК прикрепляются к бусинам и помещаются в капельки эмульсии. В результате полимеразной цепной реакции в каждой капельке образуется множество идентичных копий фрагмента – это необходимо для усиления сигнала. Бусины с ДНК помещают в шестигранные колодцы, где проходит реакция пиросеквенирования. Присоединение очередного нуклеотида вызывает вспышку флуоресценции. Если присоединяется несколько одинаковых нуклеотидов подряд, вспышка бывает более яркой. Существенной особенностью более сложной технологии, разработанной компанией "454 Life Sciences", является использование эмульсионной ПЦР для одновременной параллельной подготовки сотен тысяч препаратов ДНК к секвенированию. Принцип высокопроизводительного пиросеквенирования ДНК. Весь геном, все его молекулы ДНК, случайным образом фрагментируются на кусочки по 300–500 пар оснований. Затем комплементарные цепи фрагмента разделяются, к каждой цепи фрагментов пришивается одинаковый для всех олигонуклеотид-«адаптер», который позволяет отдельным цепям налипать на пластиковые сферы. (Последовательность этого олигонуклеотида позволяет позднее в процессе секвенирования распознавать ДНК-матрицу.). При этом смесь разъединенных на комплементарные цепи фрагментов разбавляют таким образом, что каждая сфера получает лишь по одной индивидуальной цепи. Каждая сфера оказывается заключѐнной в капельку, окруженную маслом и содержащую смесь для осуществления полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая и проходит отдельно в каждой капельке эмульсии (так называемая эмульсионная ПЦР, эПЦР). Это приводит к «клональной амплификации» цепей ДНК. Далее эмульсия разрушается, вновь двуцепочечные фрагменты ДНК (образовавшиеся в ходе ПЦР) разделяются, и сферы, несущие одноцепочечные копии ДНК-матрицы, помещаются в лунки «предметного стекла» – слайда особой конструкции. Каждая лунка такого слайда образует отдельный пиколитровый «реактор», в котором и будет происходить реакция секвенирования. Схема. ДНК фрагментируется, к фрагментам пришиваются олигонуклеотиды-«адаптеры»; полученные двуцепочечные молекулы ДНК разделяются на две комплементарные цепи. Одноцепочечные молекулы ДНК прикрепляются к сферам в условиях, стимулирующих попадание лишь одной молекулы на сферу. Отдельные сферы заключаются в капли реакционной смеси, окруженные маслом. Количество молекул на сфере увеличивается в миллионы раз в результате эмульсионной полимеразной цепной реакции (эПЦР). Эмульсия разбивается, и цепи ДНК-фрагментов, образовавшиеся в результате эПЦР, разделяются на сферы, несущие на своей поверхности миллионы одноцепочечных копий первоначального фрагмента ДНК, помещаются в лунки оптико-волоконного слайда, по одной в каждую лунку. В каждую лунку добавляются сферы поменьше, несущие на своей поверхности ферменты, необходимые для пиросеквенирования. Микрофотография эмульсии, изображающая «пустые» капли и капли, содержащие сферы с ДНК-матрицей. Толстая стрелка указывает на 100-мкм каплю, тонкая – на 28-мкм сферу. Микрофотография фрагмента оптико-волоконного слайда, полученная при помощи сканирующего электронного микроскопа. Видна плакировка оптических волокон и пустые лунки. Прибор также включает в себя встроенный компьютер с необходимым программным обеспечением для управления всем процессом. Полонисеквенирование (илюмина) («полимеразная колония») – технология секвенирования нового поколения без электрофоретического разделения, позволяющая прочитывать миллионы коротких иммобилизованных последовательностей ДНК, значительно более дешевая по сравнению с секвенированием по Сэнгеру. Основная идея метода – генерация большого числа уникальных 'полоний' (молекулярных колоний, сгенерированных полимеразой), которые секвенируются в случайном порядке. Исследуемый образец ДНК разрезают на кусочки подходящего размера (ок. 800 пар оснований), используя пневматическое устройство под названием небулайзер. Концы ДНК зачищаются и два уникальных адаптера присоединяются к фрагментам. Связанные фрагменты величиной от 150 до 200 пар оснований изолируются путем экстракции в геле и амплифицируются путем определенного количества циклов ПЦР. Подготовка образца геномной ДНК. Рандомное фрагментирование геномной ДНК и прикрепление адаптера к обоим концам фрагмента. Прикрепление ДНК к поверхности. Рандомное связывание одноцепочечных фрагментов с внутренней поверхностью каналов кюветы. Поверхность кюветы покрыта одноцепочечными олигонуклеотидами, которые отвечают на последовательности адаптеров, прикрепленных во время приготовления образца. Одноцепочечные, связанные с адаптером, фрагменты связываются с поверхностью проточной кюветы, которую затем подставляют под действие полимеразного удлинения. Прикрепление полимеразы происходит, когда свободный, дистальный конец связанного фрагмента «стыкуется» с комплиментарным олигонуклеотидом на поверхности. Стыковочная амплификация. Добавление немеченных нуклеотидов и ферментов для инициации твердофазной стыковочной амплификации. Фрагменты становятся двухцепочечными. Фермент встраивает нуклеотиды в дополнительную комплиментарную цепь двухспиральных стыковочных участков на твердофазном субстрате. Денатурация двухцепочечных молекул. Денатурация приводит к тому, что одноцепочечные шаблоны остаются прикрепленными (заякоренными) к субстрату. Полная амплификация. Несколько миллионов плотных кластеров двуцепочечной ДНК генерируются на каждом канале кюветы. Повторяемый цикл денатурации и удлинения цепи приводит к местному умножению количества копий (амплификации) единичной молекулы в миллионах разных точек по всей поверхности кюветы. Кювета, содержащая миллион уникальных последовательностей (кластеров), загружается в 1 G секвенатор с автоматическими циклами удлинения и анализа. Первый цикл секвенирования состоит в поглощении одного флуоресцентного нуклеотида, затем идет фотография (регистрация) с высоким разрешением всей кюветы, всей площадки. На картинках представлены данные, которые получаются для первого основания. Любой сигнал выше фонового означает физическое расположение кластера (или полонии), а эмиссия света (флуоресценция) определяет, какое из четырех видов оснований (A , C , G , T) попало на эту позицию. Этот цикл повторяется по одному основанию в единицу времени, получается серия картинок, каждая из которых представляет удлинение цепи на 1 нуклеотид в определенном кластере («полонии»). Тип оснований определяют с помощью алгоритма, определяющего цвет эмиссии в каждый момент времени. Определение первого основания. Первый химический цикл: инициировать первый цикл секвенирования, добавить все четыре обратимо меченных терминатора (обрывателя), праймеры и ДНКполимеразу к кювете. Снять изображение (первый снимок, фотография) с первых нуклеотидов. После возбуждения лазером регистрируют картинку эмиттированной флуоресценции от каждого кластера на кювете. Записывают тип (A,С,G,T) первого основания в каждом кластере. Определение второго основания. Второй химический цикл: инициировать следующий цикл секвенирования, добавить все четыре обратимо меченных терминатора (обрывателя), праймеры и ДНКполимеразу к кювете. Снять изображение (второй снимок, фотография) со вторых нуклеотидов. После возбуждения лазером регистрируют картинку эмиттированной флуоресценции от каждого кластера на кювете, как раньше. Записывают тип (A,С,G,T) второго основания в каждом кластере. Просеквенировать риды большим количеством химических циклов. Повторять циклы секвенирования, чтобы определить последовательность нуклеотидов в данном фрагменте, один нуклеотид за один раз. Сопоставить полученные данные. Сопоставить полученную последовательность нуклеотидов с референсной и выявить различия в последовательности. SOLiD — технология нового поколения секвенирования ДНК, позволяет секвенировать разом сотни миллионов и даже миллиарды коротких последовательностей. SOLiD использует метод лигирования в отличие от других платформ. Процесс секвенирования включает следующие шаги. Подготовка библиотеки. Геномная ДНК разрезается на малые фрагменты. Затем к концам каждого фрагмента пришиваются две различные нуклеотидные последовательности — адаптеры A1 и A2. В итоге в библиотеке оказываются одноцепочечные нуклеотидные последовательности A1-(фрагмент ДНК)-A2. ПЦР в эмульсии. ПЦР ДНК-фрагментов библиотеки проводят в водных каплях в масляно-водяной эмульсии. В каждой капле — 1μм бусина, к которой присоединены одноцепочечные нуклеотидные последовательности одного из двух праймеров (P1 или P2). Эти праймеры (P1 и P2) комплементарны адаптерам A1 и A2 соответственно. В такую каплю масла добавляют последовательность из библиотеки, и праймер на бусине будет образовывать дуплекс с одним из её адаптеров. Если на бусине — праймер P1, то с ним образует дуплекс адаптер A1. Это называется отжиг праймера. После отжига праймера добавляют ДНК-полимеразу, которая достраивает вторую цепь ДНК. После проведения ПЦР и диссоциации ДНК-дуплексов на бусинах остаются одноцепочечные последовательности ДНК. Насыщение бусин с целевой ДНК. На практике, только 30 % бусин несут целевую ДНК (ДНК-фрагмент библиотеки). Для увеличения количества таких бусин добавляют в раствор другие большие полистироловые бусины, с присоединенными одноцепочечными последовательностями другого адаптера (A2), комплементарного ПЦР-праймеру (P2). Так, каждая бусина с целевой ДНК будет составлять пару с большой бусиной за счет образования дуплекса: адаптера A2 на большой бусине и участка, соответствующего P2, бусины с целевой ДНК. Такой комплекс в итоге отделяют от «пустых» бусин, а затем его плавят, чтобы прошла диссоциация бусин с целевой ДНК и полистироловой. Эта процедура позволяет увеличить количество бусин, несущих целевую ДНК до 80 %. Затем 3’-концы, несущие последовательность P2, модифицируют для обеспечения ковалентного связывания, необходимого на следующей стадии. Перенос бусин. Продукты, полученные на предыдущей стадии, переносят на стеклянные пластины. Бусины иммобилизуют на стекле в случайном порядке, присоединяя их ковалентно к стеклу через модификации 3’-концов на бусинах. Секвенирование: Начало 1 раунда: добавление праймера длины n и 8ми нуклеотидного зонда, лигирование их друг с другом, детекция флуоресценции. Разрезание зонда, освобождение от метки. 5 последовательных циклов 1 раунда (повтор стадий 1 и 2). Начало 2 раунда: добавление праймера длины n-1 и 8ми нуклеотидного зонда, лигирование их друг с другом, детекция флуоресценции. Секвенирование проходит с помощью лигирования восьми-нуклеотидных зондов, меченных на 5’-конце одним из четырех различных флуорофоров. Последовательность зондов несет сайт гидролиза, находящийся между пятым и шестым нуклеотидами. Первые два основания (считая с 3’-конца) комплементарны двум нуклеотидам секвенируемой последовательности. С третьего по пятый основания зонда могут гибридизоваться с любыми тремя нуклеотидами секвенируемой ДНК. 6-8 основания зонда также могут гибридизоваться с любой последовательностью, однако они вместе с флуоресцентным красителем отщепляются от зонда в ходе реакции. Отщепление флуоресцентной метки вместе с основаниями 6-8 происходит таким образом, что на 5'-конце зонда остается фосфатная группа, способствующая следующему циклу лигирования зонда. Так, два основания каждого зонда точно комплементарны основаниям секвенируемой последовательности в позициях n+1 и n+2, n+6 и n+7 и т. д. Процесс секвенирования состоит из пяти раундов, каждый раунд состоит из 6-7 циклов. Каждый раунд начинается с добавления универсального праймера длины n, комплементарного P1. В каждом цикле 8-ми нуклеотидные зонды добавляются и лигируются к праймеру, их первые два нуклеотида комплементарны двум нуклеотидам секвенируемой последовательности. Затем отмывают от остающихся несвязанных зондов, измеряют флуоресценцию лигированного зонда и разрезают его между пятым и шестым основаниями. По окончании последнего цикла проводят диссоциацию синтезированной цепи ДНК от матрицы, прикрепленной к бусине. Это необходимо для того, чтобы в следующем раунде уже использовать новые праймер и зонды. Праймер теперь берут длины n-1. Итак, в ходе пяти раундов используются праймеры, комплементарные P1, длины n, n-1, n-2, n-3, n-4 относительно 3'-конца P1. Таким образом можно секвенировать примерно 25 нуклеотидов последовательности. На выходе мы получаем данные по флуоресценции. Пространство цветов и пространство нуклеотидов содержат по 4 элемента. Каждый цвет кодирует собой 4 из 16 возможных динуклеотидов. Например, «синий» цвет флуоресцентной метки соответствует паре одинаковых нуклеотидов (то есть AA,GG,TT или CC). Дизайн матрицы преобразований цвета способствует коррекции ошибок. Одним цветом кодируется: пара нуклеотидов и она же в обратном порядке (например, CA и AC); пара нуклеотидов и комплементарная ей пара (например, CA и GT); пара нуклеотидов и обратно комплементарная ей пара (например, CA и TG). Последовательность нуклеотидов может быть единственным образом преобразована в последовательность цветов. Но последовательность цветов может быть преобразована в последовательность нуклеотидов 4 разными способами. Это похоже на взаимосоответствие между нуклеотидами и аминокислотами(цвета). Преимущества метода. В данном методе каждый нуклеотид прочитывается дважды, что повышает точность секвенирования. Соответственно чтобы допустить ошибку секвенирования (пропустить SNP) необходимо оба раза неправильно определить цвет флуоресцентной метки при секвенировании соседних нуклеотидов. Ионное полупроводниковое секвенирование является методом определения последовательности ДНК, основанным на обнаружении ионов водорода, которые выделяются во время полимеризации ДНК. Это метод «секвенирования при синтезе», в ходе которого комплементарная цепь строится на основе последовательности матричной цепи. Микролунки, содержащие предназначенную для секвенирования молекулу матричной ДНК, наполняют дезоксирибонуклеотидтрифосфатом (dNTP) одного вида. Если введенный dNTP является комплементарным к ведущему нуклеотиду шаблона, он включается в растущую комплементарную цепь. Это вызывает высвобождение ионов водорода, который вызывает срабатывание ионного датчика ISFET, который указывает, что реакция произошла. Если в последовательности матричной цепи присутствует повтор одного нуклеотида, несколько молекул dNTP будут присоединены в одном цикле. Это приводит к увеличению количества образовавшихся ионов водорода и пропорционально более высокому электрическому сигналу. Технология. Включение дезоксирибонуклеотида трифосфата в растущую цепь ДНК приводит к высвобождению иона водорода и пирофосфата. Количество высвобожденных ионов водорода показывает сколько нуклеотдов было включено в цепь. Высвобожденные ионы водорода детектируются сенсорами прибора. Множественные включения приводят к росту количества высвобожденных ионов и соответствующему росту интенсивности сигнала. Включение дезоксирибонуклеотид трифосфата (dNTP) в растущую цепь ДНК происходит с образованием ковалентной связи и высвобождением пирофосфата и положительно заряженного иона водорода. dNTP будет включен, только если он комплементарен ведущему непарному нуклеотиду матричной цепи. Ионное полупроводниковое секвенирование основано на том факте, что при замене одного вида dNTP на другой высвобождается ион водорода. В каждую микролунку на полупроводниковом чипе, содержащую одну подлежащую секвенированию одноцепочечную молекулу ДНК-матрицы и ДНК-полимеразу, последовательно заливаются немодифицированные A, C, G или Т dNTP. Если введённый dNTP комплементарен следующим непарным нуклеотидом на матричной цепи, он включается в растущую комплементарную цепь с помощью ДНК-полимеразы. Если введенный dNTP не комплементарен, реакции полимеризации не происходит. Ион водорода, который выделяется в реакции, изменяет рН раствора, которое обнаруживается ISFET. Не прореагировавшие молекулы dNTP вымываются перед следующим циклом, когда будут введены другие виды dNTP. Под ион-чувствительным слоем микролунок расположены ISFET датчики. Все слои помещены на CMOS-чип, аналогичный широко используемым в электронной промышленности. Каждый чип содержит массив микролунок с соответствующими ISFET датчиками. Каждый выделившийся ион водорода вызывает срабатывание ISFET датчика. Серия электрических импульсов, передаваемых от чипа к компьютеру, переводится в последовательность ДНК без промежуточного преобразования сигнала, поскольку электроника регистрирует непосредственно события включений нуклеотидов в цепочку, без использования меченых нуклеотидов и оптических измерений. Обработка сигналов и сборка последовательности ДНК может быть выполнена программно. Основные преимущества ионного полупроводникового секвенирования — высокая скорость секвенирования при низких начальных вложениях и эксплуатационных расходах. Это стало возможным благодаря отсутствию модифицированных нуклеотидов и оптических измерений. Поскольку система записывает события присоединений нуклеотидов, осуществляемых при помощи природной полимеразы, секвенирование может происходить в режиме реального времени. На самом деле, скорость секвенирования ограничена скоростью смены нуклеотидного субстрата. Ограничения. Если гомополимер, состоящий из повторов одного и того же нуклеотида (например GGGGG), присутствует на матричной цепи (подлежащей секвенированию), присоединяются сразу несколько нуклеотидов и в одном цикле образуется больше ионов водорода. Это приводит к большему изменению рН и пропорционально более высокому электронному сигналу. Ограничение данной системы в том, что трудно посчитать длину повтора. Это ограничение характерно и для других методов, которые определяют вставки отдельных нуклеотидов, такие как пиросеквенирования. Сигналы, генерируемые длинным повтором трудно отличить от сходного другой длины, например, гомоповтор длиной 7 нуклеотидов трудно отличить от гомоповтора длиной 8 нуклеотидов. Также отмечалось значительное наличие ошибок секвенирования в виде однонуклеотидных инсерций и делеций, как правило в гетерозиготном состоянии. Другим недостатком этой системы является короткая длина читаемого фрагмента по сравнению с другими методами секвенирования, такие как секвенирование по Сэнгеру или пиросеквенирование. Большие длины читаемых фрагментов полезны для сборки генома de novo. На текущий момент длина чтения составляет 600 пар оснований за один проход. В настоящее время пропускная способность ниже, чем у других высокопроизводительных технологий секвенирования, хотя разработчики надеются изменить это путём увеличения плотности микролунок на чипе. Одномолекулярное секвенирование в реальном времени (SMRT) — метод секвенирования ДНК нового поколения. Идея метода состоит в определении последовательности ДНК за счёт наблюдения за работой единичной молекулы ДНК-полимеразы в реальном времени. При этом ДНК-полимераза достраивает вторую цепь исследуемой молекулы ДНК, используя нуклеотиды, меченные различными флуоресцентными метками; регистрируя данные метки, можно понять, какой нуклеотид ДНК-полимераза встраивает в настоящий момент. Технология секвенирования основана на секвенировании в реальном времени каждой молекулы ДНК с помощью ДНК-полимеразы. Устройство секвенаторов данного типа позволяет наблюдать на уровне единичной молекулы за синтезом комплементарной цепи одной молекулы одноцепочечной ДНК с помощью одной молекулы ДНК-полимеразы. В этой технологии флуоресцентно меченные нуклеотиды и конфокальная микроскопия высокого разрешения позволяют секвенировать последовательность в реальном времени и одновременно для многих полимераз. В основе метода лежит использование Zero-mode waveguide (ZMW) — углублений диаметром несколько десятков нанометров, ко дну которых прикреплена единичная молекула ДНК-полимеразы. Сквозь дно в ZMW-ячейку подаётся свет. Особенность конструкции ZMW-ячейки не даёт распространяться световой волне и оставляет освещённым только объём порядка 20 цептолитров (20 × 10⁻²¹ литров) около дна ячейки. Это позволяет наблюдать флуоресценцию единичной флуоресцентной метки, пришитой к нуклеотиду, в данный момент встраиваемому ДНК-полимеразой. Соответственно к четырем типам нуклеотидов пришиты разные флуоресцентные метки, что позволяет различать их. В результате при полимеризации цепи ДНК зафиксированным в ZMW ферментом можно получить зависимость интенсивности флуоресценции от времени, из графика которой по пикам разного спектра определяется последовательность ДНК. При секвенировании используются так называемые SMRT cells, содержащие порядка 150000 ZMW-ячеек, которые представляют собой углубления в алюминиевой плёнке, напылённой на кремниевую подложку. В данном методе используют метки (флуорофоры), пришитые к терминальной фосфатной группе нуклеотид. Такая метка меньше влияет на работу ДНК-полимеразы, что крайне важно при секвенировании в реальном времени. В процессе присоединения нуклеотида к растущей цепи ДНК метка отщепляется ДНК-полимеразой вместе с пирофосфатом. В результате этого флуорофор может диффундировать из наблюдаемого объёма и больше не влиять на регистрируемый сигнал, а нуклеотид без «довесков» встраивается в цепь ДНК. Таким образом, измеряя длительное (миллисекунды) свечение одного цвета при присоединении полимеразой меченного нуклеотида на фоне быстро диффундирующих (микросекунды) четырёх, можно определить последовательность матричной цепи ДНК. Преимущества. Метод одномолекулярного секвенирования в реальном времени даёт возможность получать очень длинные чтения (последовательности ДНК) (в среднем порядка 20000 нуклеотидов, вплоть до 60000 нуклеотидов), что облегчает дальнейший анализ данных и позволяет избежать ряд проблем, возникающих при работе с короткими чтениями. Он работает без предварительной амплификации исследуемой ДНК посредством ПЦР. Этот метод обеспечивает высокую скорость секвенирования (в теории она ограничена только скоростью работы ДНК-полимеразы). Для метода характерны высокая чувствительность и специфичность: возможность детектирования в смешанных образцах минорных вариантов с частотой встречаемости меньше 0,1 %. Он также даёт возможность секвенирования с высокой точностью. На данный момент она не очень высока (83 %), но точность можно повысить за счёт повторного секвенирования молекулы ДНК (> 99 % при 15 повторениях). К недостаткам метода можно отнести высокую стоимость прибора — 600000 $. Для него характерен сравнительно высокий уровень ошибок, обусловленный пересечением спектров излучения флуорофоров. Кроме того, случайное присоединение полимераз ко дну ZMW-ячейки приводит к пуассоновскому распределению числа ферментов на одну ячейку. Один из самых перспективных методов секвенирования генома. Сущность метода: нить ДНК протягивается через биологическую пору, и последовательность нуклеотидов определяется путем измерения разницы в их электрической проводимости по мере прохождения нуклеотидов через пору. Принцип работы. Нанопоровые системы представляют собой реакционную камеру, внутри которой находится раствор электролита. Камера разделена на две части липидной мембранной или иной тонкой непроводящей поверхностью, в которую внедрена единичная нанопора. К частям камеры прикладывают напряжение, из-за чего возникает ток ионов через пору. Когда исследуемые молекулы проходят через пору по направлению поля, они уменьшают сечение, доступное для ионов, и сила тока падает. Анализируя изменение силы тока, можно определить свойства молекулы, проходящей через пору. В случае нуклеиновых кислот, диаметр используемых нанопор составляет несколько нанометров, из-за чего ДНК и РНК способны проходить сквозь пору только в одноцепочечной форме, но не в двухцепочечной. При прохождении молекулы нуклеиновой кислоты через пору отдельные нуклеотиды задерживаются в определенных сайтах внутри поры, в результате чего происходит измеримое падение силы тока. Преимущества метода: дешевизна и простота использования, достигается отсутствием необходимости приготовления образца и использования реактивов; высокая чувствительность, вплоть до секвенирования без ДНК из крови или слюны; высокая длина прочтений, вплоть до десятков тысяч оснований. Главным недостатком данного метода является невысокая точность определения нуклеотидной последовательности (около 80%). Благодаря усовершенствованной методике нанопорового секвенирования сегодня определение последовательности нуклеотидов в ДНК или РНК можно выполнять на персональном приборе размером меньше смартфона. Расшифровка вирусных геномов происходит на нем практически мгновенно. На анализ генома прокариот требуется около минуты, а человеческий геном секвенируется несколько часов. Компьютерное моделирование секвенирования на основе MoS2 дало четыре различных сигнала, соответствующих основаниям двухцепочечной молекулы ДНК. Другие системы дают в лучшем случае два – A/T и C/G, – которые затем требуют сложного вычислительного анализа, чтобы отличить А от Т и С от G.