18. Выявление нужных клонов в генной библиотеке путем гибридизации с радиоактивным днк-зондом

Ответ. Метод гибридизации с радиоактивным днк-зондом широко применяется для локализации радиоактивного материала в клетке, срезе ткани или на пластине геля после электрофореза смеси макромолекул. Для регистрации радиоактивных зон на исследуемый образец накладывают рентгеновскую пленку, в которой под действием радиоактивного излучения из бромида серебра образуется металлическое серебро. «Засвеченные» участки, соответствующие радиоактивным зонам, наблюдаются визуально после проявления пленки. Одним из вариантов радиоавтографии является флюорография. В этом случае в исследуемый образец импрегнируют сцинтиллятор и вновь накладывают рентгеновскую пленку. Метод основан на том, что низкоэнергетические Р-частицы, образующиеся при распаде изотопа (например, трития), взаимодействуют с молекулами сцинтиллятора, при этом энергия радиоактивного распада преобразуется в световую энергию, которая и регистрируется рентгеновской пленкой, чувствительной к синей области спектра. Все операции при радиоавтографии необходимо проводить в темноте, чтобы не засветить пленку. Очень важной областью применения радиоавтографии является обнаружение радиоактивного ДНК-зонда после его гибридизации с препаратом ДНК, подвергнутым электрофоретическому разделению. К сожалению, провести гибридизацию в самом геле невозможно, поскольку зонд не может в него проникнуть. Поэтому ДНК после электрофореза переносят на нитроцеллюлозный или найлоновый фильтр по методу Саузерна (Саузернблотгинг) или с помощью элюции. Расположение молекул ДНК на фильтре в точности соответствует таковому в геле. Перенесенную на фильтр ДНК подвергают денатурации и фиксируют, а затем проводят гибридизацию с радиоактивным ДНК-зондом. Гибридизационный сигнал регистрируют радиоавтографическими методами. ДНК сначала переводят в одноцепочечную форму, подвергнув ее тепловой обработке или воздействию щелочью. В этих условиях водородные связи между основаниями разрываются и цепи расходятся. На чашки Петри с плотной средой помещают стерильные нитроцеллюлозные фильтры и стандартным способом наносят на них бактериальные клетки, содержащие рекДНК. Питательная среда свободно диффундирует через фильтр, и на нем образуются колонии клеток. С них делают перепечатки на чашки с аналогичной средой и таким образом получают "справочную" библиотеку клонов, из которой берут затем клетки с искомыми рекДНК. Далее фильтры с чашек переносят на листы ватмана, смоченные в 0,5 н NaOH, где клетки лизируются, а освободившаяся ДНК денатурируется. После этого фильтры обрабатывают протеиназой К для удаления белков, выдерживают при 80 °С для фиксации ДНК на фильтрах, затем промывают последовательно буферным раствором (рН 7,6) и хлороформом. Далее их сушат и приступают к самой процедуре гибридизации. Для этого фильтры смачивают в цитратном буфере, содержащем 50% формамида и меченный радиоактивным фосфором зонд, и выдерживают 15–20 ч при 42 °С под слоем масла. После отмывки формамида и радиоактивности нейтральным буфером остатки негибридизовавшегося зонда гидролизуют нуклеазой S1. Далее фильтры вновь промывают, подсушивают и авторадиографируют на рентгеновских пленках при –70 °С. Проявленные рентгеновские пленки совмещают с контрольными чашками из "справочной" библиотеки клонов. Пятна на пленках позволяют выявить на чашках те колонии, которые содержат рекДНК. Отметим, что все большее распространение получают и нерадиоактивные метки. Данный метол используется также для поиска определенных клонов среди фаговых негативных колоний (до 50 тысяч на одной чашке Петри). Однако в отдельной негативной колонии недостаточно фаговой ДНК для ее проявления при авторадиографии. Поэтому в данном случае вначале проводят амплификацию фагов: стерильные нитроцеллюлозные фильтры смачивают в суспензии индикаторных бактерий, содержащей около 1000000 клеток в 1 мл, подсушивают на листе ватмана, наносят на чашки с негативными фаговыми колониями и помещают в холодильник. После 30 мин выдержки, позволяющей фагам диффундировать в фильтры, их переносят на свежие чашки с питательной средой и инкубируют в течение 12 ч при 37 °С. За это время на поверхности фильтров образуется газон индикаторных бактерий с копиями негативных колоний, содержащими повышенное число фагов. Далее описанным ранее способом осуществляют гибридизацию колоний, слегка варьируя условия опыта. Благодаря амплификации фагов время авторадиографии значительно сокращается (до нескольких часов). С одной чашки можно сделать несколько перепечаток фильтрами, что позволяет проводить параллельные опыты с тем же или другими зондами. "Справочной" библиотекой клонов служат чашки с первичными негативными колониями. Обычно размер зонда варьирует от 100 до 1000 п.н. и более, хотя можно использовать как более крупные зонды, так и зонды меньшего размера. Для гибридизации, т. е. для образования стабильного комплекса, необходимо, чтобы на участке длиной 50 нуклеотидов совпадало более 80% из них, но это зависит от условий реакции. Меченые ДНК-зонды можно получить разными способами. Один из них, называемый методом случайных праймеров, основан на применении смеси синтетических олигонуклеотидов (олигомеров), содержащих все возможные комбинации из шести нуклеотидов. Некоторые из этих олигонуклеотидов оказываются комплементарными последовательностям ДНК-мишени и гибридизуются с ними, если ДНК предварительно денатурировать. После отжига олигонуклеотидов с денатурированной ДНК-матрицей в реакционную смесь добавляют четыре дезоксирибонуклеотида (дезоксирибонуклеозид-трифосфаты; dNTP), один из них – меченый, и фрагмент ДНК полимеразы 1 Е. coli (фрагмент Кленова). Фрагмент Кленова обладает ДНК-по-лимеразной и З'-экзонуклеазной активностями, но не 5'-экзонуклеазной активностью, присущей ДНК-полимеразе I Е. coli, которая могла бы расщепить новосинтезированные молекулы ДНК. Одиночные цепи ДНК-мишени служат матрицами для синтеза новых молекул ДНК, а связанные с ними случайным образом олигонуклеотиды — затравками. При радиоактивном мечении один из dNTP содержит а-32Р, так что 32Рмеченным оказывается и сам зонд. Радиоактивную метку выявляют с помощью радиоавтографии. В качестве нерадиоизотопной метки часто используют биотин, который присоединяют к одному из четырех dNTP. Для выявления гиоридизовавшегося биотинилированного зонда на фильтр наносят конъюгат стрептавидина с соответствующим ферментом (например, щелочной фосфатазой). Стрептавидин образует комплекс с биотином, который обнаруживается благодаря тому, что под действием фермента образуется окрашенное или люминесцирующее вещество – продукт превращения нанесенного на фильтр субстрата. Зонды для скрининга геномной библиотеки можно получить, по крайней мере, двумя способами. Во-первых, можно использовать клонированную ДНК близкородственного организма (гетерологичный зонд). В этом случае условия гибридизации нужно подбирать таким образом, чтобы она могла происходить при существенном расхождении между нуклеотидными последовательностями зонда и искомой ДНК; это позволяет решить проблемы, связанные с заведомым различием между ДНК – источником зонда и исследуемой ДНК. Во-вторых, зонд можно получить методом химического синтеза, основываясь на известной аминокислотной последовательности белкового продукта искомого гена. На практике используют олигонуклеотидные зонды, содержащие не менее 20 нуклеозидных остатков. Конечно, их синтез возможен, если известно строение гена или, как минимум, соответствующего белка либо его части. Но изза вырожденности кода восстановить адекватную нуклеотидную последовательность по аминокислотной последовательности нельзя. Поэтому для синтеза зонда выбирают такую часть гена, в которой преимущественно находятся кодоны уникальных (Met, Trp) или «безопасных» (Asn, Asp, Cys, His, Phe, Tyr, Gly, Glu, Lys) аминокислот. В последнем случае ошибки в выборе кодонов приводят только к замене пурина на пурин или пиримидина на пиримидин. Это наименьшим образом дестабилизирует дуплекс зонд-ген в процессе гибридизации. Тем не менее, для компенсации ослабления водородных связей в дуплексе длину таких олигонуклеотидных зондов увеличивают. Другой выход заключается в синтезе набора зондов стандартной длины, в котором представлены все возможные варианты строения зонда. С целью скрининга используют комбинацию всех вариантов.