5. Другие ферменты нуклеазного действия (s1-нуклеаза, Bal31-нуклеаза, нуклеаза из микрококка, днк-аза)

Ответ. Некоторые эндонуклеазы гидролизуют одноцепочечные молекулы ДНК примерно в тысячу раз быстрее, чем двухцепочечные. Такая специфичность используется во многих экспериментах - при конструировании рекомбинантных ДНК, при гетеродуплексном анализе и даже при анализе экспрессии генов. Некоторые реакции, катализируемые подобными эндонуклеазами. Несколько разных эндонуклеаз такого типа были достаточно хорошо очищены и охарактеризованы, чтобы их можно было использовать в качестве реактивов. Одна из них, нуклеаза S1, получена из высушенных препаратов плесневого гриба Aspergillus oryzae; источниками двух других широко используемых ферментов являются Neurospora и Mung beans. Каждый из этих трех ферментов проявляет максимальную активность и точность распознавания одноцепочечных и двухцепочечных молекул при определенных условиях. Все три фермента гидролизуют как ДНК, так и РНК. При разрыве фосфодиэфирных связей с помощью этих ферментов образуются 5'-монофосфатные и З'-гидроксильные концы. Псевдомонада Alteromonas espejiana секретирует единственную дезоксирибонуклеазу, получившую название Bal 31. В отношении одноцепочечной ДНК, в том числе одноцепочечных участков двухцепочечной ДНК, Bal 31 ведет себя как эндонуклеаза, действуя аналогично другим эндонуклеазам, специфичным к одноцепочечным ДНК. Однако в отношении интактной двухцепочечной ДНК этот фермент проявляет экзонуклеазную активность, по-видимому, благодаря тому, что он способен распознавать локальные одноцепочечные участки. Bal 31 разрезает обе цепи на обоих концах дуплекса, т.е. осуществляет деградацию одновременно в направлениях 3' - >5' и 5'->3'. В результате двухцепочечная молекула постепенно укорачивается. Если эмпирически оценить скорость этого процесса, то с помощью фермента Bal 31 можно получать фрагменты ДНК нужной длины. Хотя укорочение разных молекул ДНК происходит несинхронно, получается набор фрагментов, длина которых близка к заданной. В результате исчерпывающего гидролиза с помощью Bal 31 промежуточные олигонуклеотидные продукты расщепляются до 5'-мононуклеотидов. Микрококковая нуклеаза — фермент, основным свойством которого является способность разрывать первичную структуру нуклеиновых кислот, в частности, ДНК, на участках между нуклеосомами. Другими словами, микрококковая нуклеаза отделяет нуклеосомы друг от друга, разрушая соединяющий их участок ДНК, но не воздействуя на участок ДНК, непосредственно связанный с гистоновыми белками. Препараты микрококковой нуклеазы применяются в молекулярной биологии для исследований молекул хромосомных ДНК. ДНКаза — эндонуклеаза, закодированная геном DNASE1 в геноме человека. Синтезируется в основном в тканях пищеварительного тракта. Высокий уровень в моче, также присутствует в семенной жидкости и слюне. ДНКаза I — нуклеаза, расщепляющая фосфодиэфирные связи в ДНК вблизи пиримидиновых нуклеотидов, образуя при этом полинуклеотиды с концевым-5'-фосфатом и свободной гидроксильной группой на 3'-конце. Обычно расщепление идет до тетрануклеотидов. Субстратами ДНКазы I являются: одноцепочечная ДНК, двуцепочечная ДНК, хроматин. ДНКаза I является эндонуклеазой, расщепляющей чужеродные и ненужные молекулы ДНК, также показана роль этого фермента во фрагментации ДНК при апоптозе/ Известно, что ДНКаза I связывает мономеры белка цитоскелета актина с высоким сродством (константа диссоциации ~ нМ) и полимеры актина с более низким сродством. Дезоксирибонуклеаза IV (фаг-Т4 индуцируемая), эндодезоксирибонуклеаза IV (индуцируемая фагом Т4), эндонуклеаза IV E. coli, эндодезоксирибонуклеаза, редоксиэндонуклеаза, дезоксрибоэндонуклеаза, эндонуклеаза Escherichia coli II, эндонуклеаза II, ДНК-аденин-трансфераза) — это вид эндонуклеазы, которая катализирует деградацию нуклеотидов в двухцепочечной ДНК, атакуя 5'-терминальный конец. Дезоксирибонуклеаза IV представляет собой тип дезоксирибонуклеазы, которая функционирует в безнуклеотидных или апуриново-апиримидиновых сайтах (AP-сайтах), когда клетка подвергается эксцизионной репарации нуклеотидов. Кроме того, эндонуклеаза IV имеет нескольких активностей, таких как AP-эндонуклеазная, 3'-диэстеразная, 3'-> 5'-экзонуклеазная и 3'-фосфатазная. Дезоксирибонуклеаза IV была впервые выделена из тканей кролика в 1968 году, и её молекулярная масса составила 42000 дальтон. Было обнаружено, что этот фермент напоминает несколько микробных эндонуклеазных активностей ДНК-полимеразы I, обнаруженных в Escherichia coli, которые, по-видимому, необходимы для репарации и рекомбинации ДНК. ДНКаза IV состоит из 185 аминокислотных остатков, а ионы магния действуют как кофактор. Ион двухвалентного металла, такой как Mg²⁺, действует как кофактор во время расщепления 5'-мононуклеотидов. Его бета-цилиндрическое ядро TIM окружено спиралями с тремя ионами металлов — либо тремя Zn2+, либо двумя Zn2+ и одним Mn2+, которые играют решающую роль в AP эксцизионной репарации. 70 % общей активности ДНКазы IV было обнаружено в цитоплазме, а 30 % — в ядрах клеток/ В организме человека ДНКаза IV необходима для расщепления промежуточного продукта реакции, генерируемого смещением цепи матрицы во время заполнения пробелов. Во время эндонуклеазной активности конформационные изменения в ДНК происходят таким образом, что за счет изгиба ДНК на 90 градусов обнажается безнуклеотидный сайт, что приводит к переворачиванию сахарного фрагмента в небольшой карман, который не образует пару оснований Уотсона-Крика.

6. ДНК-зависимые ДНК-полимеразы

Ответ. ДНК-полимеразы – фермент, участвующий в репликации, способен синтезировать новые цепи ДНК с матричной цепи. Ферменты этого класса катализируют полимеризацию дезоксирибонуклеотидов вдоль цепочки ДНК, фермент «считывает» и использует в качестве шаблона. Новый тип нуклеотида определяется по принципу комплементарности к матрице, с которой ведется считывания. Молекула ДНК, синтезируется, является комплементарной к матричной цепи и идентична с одним из цепей второй двойной спирали. Полимераза позволяет химическим соединениям отдельных молекул (мономеров) образовывать цепь (полимер). В случае ДНК-полимеразы образующийся полимер представляет собой дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК). Мономеры представляют собой дезоксирибонуклеотиды, точнее дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP). ДНКзависимая ДНК-полимераза всегда использует уже существующую одиночную цепь ДНК в качестве матрицы для синтеза новой комплементарной цепи, нуклеотидная последовательность которой, таким образом, определяется шаблоном. Это сохранение последовательности ДНК имеет решающее значение для способности ДНК-полимеразы копировать генетическую информацию, закодированную в ДНК. Правильное копирование матрицы достигается путем комплементарного спаривания включенных нуклеотидных оснований с основаниями матрицы ДНК, опосредованного водородными связями. Синтез новой цепи ДНК происходит от 5 до 3′ конца. Химически происходит нуклеофильная атака концевой 3‘-гидроксильной группы цепи ДНК на α-фосфат dNTP с высвобождением пирофосфата. Этот этап катализируется полимеразой. В отличие от РНК-полимераз (производит РНК, которая используется для синтеза белков из аминокислот), синтез комплементарной цепи ДНК в ДНКполимеразах может происходить только в том случае, если для полимеразы доступен свободный 3′-гидрокси-конец. Затем к этому концу присоединяется первый нуклеотид. В полимеразной цепной реакции (ПЦР) однониточная ДНК (праймер) длиной около 15–20 нуклеотидов используется в качестве начальной точки реакции. Для ферментов обычно требуются ионы магния в качестве кофактора. Катализ образования диэфирной связи функционально аналогичен соответствующей реакции РНК-полимераз. Последний нуклеотид уже синтезированного участка и нуклеотид, который должен быть добавлен, координируются с одним из двух ионов магния, каждый в каталитическом центре полимеразного домена. Первая фосфатная группа добавляемого нуклеотида координируется с обоими ионами магния. Пространственное положение позволяет гидроксигруппе предыдущего нуклеотида атаковать фосфатную группу добавляемого нуклеотида. При этом отщепляется пирофосфатный остаток. Процессы в активных центрах ДНК-полимеразы, где катализируются реакции нуклеиновых кислот. Многие полимеразы также выполняют другие функции ферментов. В присутствии низких концентраций дНТФ преобладает 3→5‘ экзонуклеазная активность по удалению нуклеотидов. Некоторые полимеразы также обладают экзонуклеазной активностью 5→3‘. Чтобы гарантировать отсутствие ошибок при чтении матрицы ДНК, они имеют эту функцию корректирующего считывания, т.е. они могут обнаружить вставку неподходящего нуклеотида, а затем удалить его из ДНК с помощью экзонуклеазной активности. Это делает возможным деградацию существующей цепи ДНК или РНК, которая уже спарена с цепью матрицы, пока формируется новая цепь. Это приводит к замене старой пряди на новую. Эта экзонуклеазная активность используется методом ник-трансляции. Различные ДНК-полимеразы. Было обнаружено три класса полимераз у прокариот (I, II, III) и полимеразы α, β, γ, δ, ε у эукариот.

У млекопитающих встречается только пять типов: α, β, γ, δ и ε. Предполагается, что полимеразы δ и ε, которые имеют решающее значение для репликации, характеризуются высокой вычислительной мощностью и функцией контрольного считывания. Напротив, полимеразы α и β демонстрируют только низкую вычислительную мощность и не имеют функции контрольного считывания. У бактерий, таких как Escherichia coli, есть три различных ДНК-зависимых ДНК-полимеразы. Одна из них, ДНК-полимераза I (PolI) стала первой полимеразой, когда-либо обнаруженной. Однако это не самая важная полимераза для репликации в E. coli, так как она катализирует всего около 20 стадий синтеза (то есть имеет только низкую вычислительную мощность). Однако он отвечает за деградацию праймера во время репликации из-за своей 5→3‘ экзонуклеазной активности. ДНК-полимераза II и ДНК-полимераза III, две другие ДНК-полимеразы в E. coli, были выделены только через 15 лет после открытия ДНК-полимеразы I, после того, как мутанты E. coli с дефектом в гене полимеразы I, тем не менее, оказались компетентными для репликация. Однако эти мутанты были особенно чувствительны к УФ-излучению и алкилирующим веществам, поэтому предполагается, что ДНК-полимераза I в основном выполняет задачи репарации. Полимераза III, которая осуществляет фактическую репликацию в E. coli, состоит всего из семи субъединиц и встречается лишь в очень небольшом количестве копий на бактериальную клетку. Единственная известная независимая ДНК-полимераза – это терминальная дезоксирибонуклеотидилтрансфераза. ДНК-полимеразы имеют центральное значение для репликации ДНК. Они позволяют точно копировать генетическую информацию в форме ДНК, что является решающим шагом в воспроизводстве и воспроизведении живых организмов. Ферменты также играют важную роль в процессах, связанных с репарацией ДНК. В лаборатории ДНК-полимеразы часто используются для полимеразной цепной реакции и связанных методов (например, RT-PCR, qPCR), для ник-трансляции, случайного праймирования и секвенирования ДНК. Большое количество различных термостабильных типов (например, полимераза Taq из Thermus aquaticus), некоторые из которых модифицированы с помощью белковой инженерии. Помимо высокой температурной стабильности, термостабильные ДНК-полимеразы архаичного происхождения, такие как полимераза Pfu, обеспечивают надежное считывание, поскольку ПЦР не должна приводить к каким-либо изменениям в продуцируемой ДНК.

7. ДНК-зависимые РНК-полимеразы

Ответ. Транскрипция – процесс синтеза РНК на матрице ДНК, первая стадия экспрессии генетического материала. Процесс транскрипции ДНК в клетках всех организмов осуществляется ДНК-зависимыми РНК-полимеразами. Существует два основных типа РНК-полимераз – односубъединичные и многосубъединичные. Односубъединичные РНК-полимеразы участвуют в транскрипции геномов некоторых бактериофагов, а также митохондрий. Многосубъединичные РНК-полимеразы (РНКП) отвечают за транскрипцию большинства генов в клетках всех живых организмов. Структура РНКП и общий механизм синтеза РНК высококонсервативны и в основных чертах очень сходны у бактерий, архей и эукариот. У эукариот имеется несколько различных РНКП, между которыми разделяются функции синтеза мРНК, тРНК и рРНК. В клетках прокариот имеется только одна РНКП, которая синтезирует все типы РНК в клетке. Известны две формы РНКП: кор- и холофермент. Кор-фермент имеет относительную молекулярную массу около 400 кДа и состоит из пяти субъединиц: двух α, β, β′и ω. Гомологичные субъединицы входят в состав всех известных многосубъединичных РНКП. Холофермент состоит из кор-фермента и ζ-субъединицы. Транскрипционный цикл, осуществляемый РНК-полимеразой, включает в себя 3 последовательные стадии – инициацию, элонгацию и терминацию синтеза РНК. Кор-фермент РНКП обладает каталитической активностью, но не способен к инициации транскрипции. Для узнавания специфических последовательностей ДНК (промоторов) необходимо присоединение фактора инициации – ζсубъединицы, – и образование холофермента РНКП. ζ-субъединица играет центральную роль в узнавании промоторов, плавлении ДНК и последующем уходе РНКП с промотора. По своей структуре кор-фермент РНКП напоминает клешню краба, одна половина которой образована в основном β′-, а вторая – β-субъединицей; между ними находится главный канал РНКП, в котором происходит связывание ДНК и РНК в процессе транскрипции. Димер α-субъединиц располагается со стороны, противоположной главному каналу; ω-субъединица контактирует с β′- субъединицей на внешней стороне РНКП. Активный центр фермента образован β′- и β-субъединицами и располагается в глубине главного канала. Сбоку от главного канала расположен вторичный канал, который соединяется с главным в области активного центра. Вторичный канал служит местом связывания многих регуляторных факторов, и основным путем поступления нуклеотидов в активный центр РНКП. Реакции, катализируемые РНК-полимеразой. Все реакции, осуществляемые РНКП, протекают по механизму бимолекулярного нуклеофильного замещения (SN2): во всех случаях РНКП катализирует перенос нуклеозидмонофосфата с молекулы-донора на молекулу-акцептор. В катализе участвуют два иона Mg2+, координированных в активном центре РНКП. Первый ион Mg2+ (Mg I) прочно связан с тремя остатками аспарагиновой кислоты абсолютно консервативного для всех РНКП мотива NADFDGD β′-субъединицы. Второй ион магния (Mg II) связан с РНКП гораздо слабее, так как в его связывании принимает участие только один остаток аспарагиновой кислоты, но он дополнительно координируется молекулами воды. В процессе транскрипции РНКП способны осуществлять несколько различных реакций: синтез РНК, пирофосфоролиз (перенос нуклеозидмонофосфата с 3‘-конца новосинтезированной РНК на пирофосфат, в результате чего образуется НТФ), а также экзо- и эндонуклеазное расщепление РНК-транскрипта (перенос нуклеозид монофосфата (экзонуклеазное) с 3‘-конца новосинтезированной РНК, либо нескольких 3‘-концвых нуклеотидов (эндонуклеазное) на молекулу воды, в результате чего образуется свободный НМФ или короткий фрагментРНК). В отличие от ДНК-полимераз, имеющих отдельный активный центр для расщепления ДНК, в РНКП все реакции осуществляются в одном активном центре, что делает данную молекулярную машину уникальным ферментом. Биологическая роль такого многообразия реакций, катализируемых РНКП, крайне высока: расщепление РНК играет большую роль в реактивации комплексов после включения неправильного нуклеотида.

8. РНК-зависимые ДНК-полимеразы

Ответ. РНК-зависимая ДНК-полимераза (ревертаза или обратная транскриптаза (ОT)) представляет собой фермент, используемый для создания комплементарной ДНК (кДНК) из РНК матрицы, процесс называется обратной транскрипцией. Обратные транскриптазы используются некоторыми вирусами, такими как ВИЧ и вирус гепатита В, для репликации своих геномов, мобильными генетическими элементами ретротранспозона для пролиферации в геноме хозяина и эукариотическими клетками для удлинения теломер на концах их линейных хромосом. Вопреки широко распространенному мнению, этот процесс не нарушает потоки генетической информации, описанные в классической центральной догме, поскольку передача информации от РНК к ДНК явно считается возможной. Ретровирусная ОТ имеет три последовательных биохимических активности: активность РНК-зависимой ДНК-полимеразы, активность рибонуклеазы H (РНКаза H) и активность ДНК-зависимой ДНК-полимеразы. В совокупности эти активности позволяют ферменту превращать одноцепочечную РНК в двухцепочечную кДНК. В ретровирусах и ретротранспозонах эта кДНК может затем интегрироваться в геном хозяина, из которого могут быть созданы новые копии РНК посредством транскрипции клетки-хозяина. Та же последовательность реакций широко используется в лаборатории для преобразования РНК в ДНК для использования в молекулярном клонировании, секвенировании РНК, полимеразной цепной реакции (ПЦР) или анализе генома. Наиболее детально изучена ревертаза ретровирусов птиц. Каждый вирион содержит около 50 молекул этого фермента. Обратная транскриптаза состоит из двух субъединиц — a (65 кДа) и b (95 кДа), присутствующих в эквимолярном количестве. Обратная транскриптаза обладает, по крайней мере, тремя ферментативными активностями: ДНК-полимеразной, использующей в качестве матрицы как РНК, так и ДНК; активностью РНКазы Н, гидролизующей РНК в составе гибрида РНК– ДНК, но не одно- или двухцепочечную РНК; ДНК-эндонуклеазной активностью. Первые две активности необходимы для синтеза вирусной ДНК, а эндонуклеаза, по-видимому, важна для интеграции вирусной ДНК в геном клетки-хозяина. Очищенная обратная транскриптаза синтезирует ДНК как на РНК-, так и на ДНК-матрицах. Чтобы начать синтез, ревертазе, как и другим полимеразам, необходим короткий двухцепочечный участок (праймер). Праймером может служить одноцепочечный сегмент как РНК, так и ДНК, которые в процессе реакции оказываются ковалентно связанными с новосинтезированной цепью ДНК. Обратную транскриптазу преимущественно используют для транскрипции матричной РНК в комплементарную ДНК (кДНК). Реакцию обратной транскрипции проводят в специально подобранных условиях с использованием сильных ингибиторов РНКазной активности. При этом удается получать полноразмерные ДНК-копии целевых молекул РНК. В качестве праймера при обратной транскрипции поли (А)-содержащих мРНК используют олигo (dT), а для молекул РНК, не имеющих З'-поли (А) концов, – химически синтезированные олигонуклеотиды, комплементарные З'-концу изучаемой РНК. После синтеза на мРНК комплементарной цепи ДНК и разрушения РНК (обычно применяют обработку щелочью) осуществляют синтез второй цепи ДНК. При этом используют способность ревертазы образовывать на 3'-концах одноцепочечных кДНК самокомплементарные шпильки, которые могут выполнять функции праймера. Матрицей служит первая цепь кДНК. Данная реакция может катализироваться как ревертазой, так и ДНК-полимеразой I E. coli. Показано, что сочетание этих двух ферментов позволяет повысить выход полноценных двухцепочечных молекул кДНК. По окончании синтеза первая и вторая цепи кДНК остаются ковалентно связанными петлей шпильки, служившей праймером при синтезе второй цепи. Эту петлю расщепляют эндонуклеазой S1, специфически разрушающей одноцепочечные участки нуклеиновых кислот. Образующиеся при этом концы не всегда оказываются тупыми, и для повышения эффективности последующего клонирования их репарируют до тупых с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E. coli. Полученную двухцепочечную кДНК можно затем встраивать в клонирующие векторы, размножать в составе гибридных молекул ДНК и использовать для дальнейших исследований. Чтобы начать синтез, ревертазе, как и другим полимеразам, необходим короткий двухцепочечный участок (праймер). Праймером может служить одноцепочечный сегмент как РНК, так и ДНК, которые в процессе реакции оказываются ковалентно связанными с новосинтезированной цепью ДНК. В генетической инженерии используют как олиго-(дТ) праймеры, комплементарные 3'-полиА концам мРНК, так и набор ―случайных‖ по составу и последовательности гексануклеотидов (random primers). Часто для молекул РНК с известной первичной последовательностью, не имеющих З'-поли (А) концов, используют химически синтезированные олигонуклеотиды, комплементарные З'- концу.

9. ДНК-лигазы

Ответ. НАД-зависимая ДНК-лигазы Tfi из термофильной бактерии Thermus filiformis – первая ДНК-лигаза, для которой методом рентгеноструктурного анализа установлена 3-мерная структура. Этот фермент, как и все ДНК-лигазы, имеет модульную организацию и состоит из 4 основных доменов. Он имеет длину 667 аминокислотных остатков (мол. м. 75,9 кД). Самым большим является N-концевой домен 1, состоящий из двух субдоменов. На самом конце находится субдомен 1а длиной 73 остатка, являющийся сайтом связывания кофактора НАД+. Субдомен 1b (остатки 73–317) образован 3 антипараллельными b-слоями и несколькими фланговыми aспиралями и является доменом аденилирования. Субдомен 1b содержит остаток лиз116 активного центра, подвергающийся аденилированию. Следующий домен 2 является доменом связывания олигонуклеотидов, т. к. он имеет укладку связывания олигомеров ОВ, похожую на укладку взаимодействия с онДНК у связывающих он ДНК белков. Домены 1 и 2 содержат все 5 консервативных мотивов нуклеотидилтрансфераз и вместе образуют минимальный домен ДНКлигазы, достаточный для каталитической активности, т. к. в их пределах расположены все каталитически существенные аминокислотные остатки и остатки, необходимые для специфического связывания ДНК-лигазы с ОР ДНК. Домены 1 и 2 физически взаимодействуют друг с другом, что вызывает значительное повышение аденилирующей активности домена 1. Для такого взаимодействия необходимо сильное изменение конформации белка со смещением С-концевой части домена 2 в сторону домена 1. Домен 3 (остатки 403–581) является вторым «некаталитическим» контактным участком, обеспечивающим связывание ДНК-лигазы с ДНК. Он образован 2 сегментами белка. Область остатков 403–429 содежит 4 консервативных остатка цистеина, образующих цинковый палец типа Сys4, а смежная область остатков 429–581 включает 4 копии мотива спираль-шпилькаспираль. Обе структуры часто используются белками для взаимодействия с ДНК. На самом С-конце ДНК-лигазы Tfi расположен необычный домен 4, или BRCT, гомологичный C-концевому домену эукариотического белка BRCA1, ассоциированного с раком молочной железы. Он состоит из 4-нитевого параллельного b-слоя и трех a-спиралей и имеется у очень многих лигаз. Домен 4 очень подвижен в так называемой «открытой» конформации ДНК-лигазы и сближен с N-концевым доменом 1а в «закрытой» конформации, в которой лигаза принимает тороидальную форму. Предполагается, что домен 4 играет в лигазе роль ворот, регулирующих связывание и освобождение днДНК. Подобно белку PCNA, в закрытой конформации ДНК-лигаза может образовывать скользящий зажим на ДНК и двигаться по ДНК до тех пор, пока она не встретит ОР. Аналогичную доменную структуру имеет ДНК-лигаза LigA E. coli, а в лигазе LigB отсутствуют два остатка цистеина цинкового пальца и весь С-концевой домен BRCT. В исходном состоянии (А) лигаза находится в закрытом неактивном состоянии и неспособна связываться с ДНК. Аденилирование под действием НАД+ или АМФ (стадия I) переводит лигазу в открытое активированное состояние (В), в котором она неспецифически связывается с днДНК, вновь переходит в закрытое состояние С (стадия II) и транслоцируется по днДНК до тех пор, пока не встретит ОР в одной из нитей. Узнавание ОР в ДНК (стадия III) сопровождается изгибанием ДНК и изменением конформации белка на контактной поверхности между доменами 1 и 2. В результате 5‘- и 3‘-концы ОР оказываются в щели между этими доменами и сближаются с аденилированным остатком лиз116. Это обеспечивает деаденилирование белка и перенос АМФ на 5‘-конец разорванной нити (стадия IV). В этом состоянии лигаза связывает катионы Mg2+, необходимые для атаки 3‘-гидроксильной группы нити ДНК на активированный АМФ 5‘-конец онДНК (стадия V). В результате происходит воссоединение ОР, освобождение неорганического фосфата pi и изменение конформации лигазы с переходом в открытую форму (F). Лигированная ДНК освобождается от ДНК-лигазы, которая возвращается в исходное неактивное закрытое состояние А (стадия VI). Для активности ДНК-лигаз необходимы нуклеотидные кофакторы, в зависимости от природы которых лигазы можно разбить на два класса. ДНК-лигазы эукариотов, археев, бактериофагов, эукариотических вирусов и некоторых эубактерий используют в качестве кофакторов АТФ и относятся к классу I. ДНК-лигазы класса II, кофактором которых служит НАД+, имеются исключительно у эубактерий. ДНК-лигазы LigA и LigB у E.coli принадлежат к этому классу. Лигаза фага Т4 (АТФ в присутствии Mg2+) более универсальна, так как помимо лигирования липких концов способна катализировать реакцию воссоединения двухцепочечных фрагментов ДНК с тупыми концами. Она используется чаще. Нуклеотиды хоть и разные, но механизм реакции с АТФ и НАД получается одинаковый, отличие оказывается только в уходящей группе (никотинамидфосфат или аденозиндифосфат). Таким образом сшиваются все разрывы между фрагментами Оказаки, которые образовались. ДНК-полимераза удаляет затравку, застраивает полученную «брешь», а полученный однонитевой разрыв, который она оставляет, в силу специфики ее ферментных активностей, зашивается ДНК-лигазой. Для связывания ДНК-лигаз с ОР в днДНК абсолютно необходима 5‘-фосфатная группа, а 3‘-ОН-группа не обязательна. Однако обе группы требуются для реакции лигирования. ДНК-лигазы воссоединяют в ДНК только ОР, но не бреши, и пробел длиной даже в 1 н. полностью устраняет связывание фермента с ДНК. ДНК-лигазы участвуют в воссоединении фрагментов Оказаки, образующихся во время синтеза отстающей нити в процессе репликации. Кроме того, ДНК-лигазы устраняют ОР ДНК в процессах репарации и рекомбинации. Прототипом бактериальных ДНК-лигаз является продукт гена ligA (ранее lig) E. coli. Эта ДНК-лигаза имеет длину 671 остаток (мол. м. 73,7 кД), вызывает воссоединение ОР во всех процессах метаболизма ДНК (репликации, репарации и рекомбинации) и является абсолютно необходимой для роста клеток. В последнее время в полностью секвенированном геноме E. coli была обнаружена открытая рамка считывания, названная ligB и кодирующая вторую, более короткую ДНК-лигазу длиной 562 аминокислотных остатка, гомологичную LigA. Лигаза LigB также катализирует воссоединение ОР в ДНК in vitro, но еѐ физиологическая роль пока не установлена. У млекопитающих идентифицированы 4 разных типа ДНК-лигаз, содержащихся в ядерных экстрактах клеток. Главной функцией ДНК-лигазы I явлется воссоединение фрагментов Оказаки, хотя она участвует и в репарации ДНК. ДНК-лигаза I человека имеет длину 919 остатков (мол. м. 102 кД) и кодируется геном LIG1, расположенным в хромосоме 19 и содержащим 27 интронов. ДНК-лигазы III, участвующая в эксцизионной репарации ДНК, и III‘, (известная также как ДНК-лигаза II) кодируются альтернативно сплайсированными мРНК одного и того же гена, и их аминокислотные последовательности различаются только на С-конце. ДНК-лигаза IV по субстратной специфичности отличается от ДНК-лигаз I и III и у мышей является существенным белком. Она участвует в негомологическом соединении концов ДНК во время репарации двунитевых разрывов ДНК. У дрожжей S. cerevisiae отсутствуют гомологи ДНК-лизаз III млекопитающих, а гомолог ДНК-лигазы IV кодируется геном DNL4/LIG4 и также участвует в негомологическом соединении концов ДНК. Главная ДНКлигаза I у дрожжей кодируется ядерным геном CDC9. Продуктами этого гена являются два белка, которые транслируются в одной рамке считвания, но с использованием разных инициирующих кодонов. При инициации трансляции на первом кодоне АУГ образуется белок длиной 755 остатков, имеющий на N-конце функциональную предпоследовательность, которая нацеливает белок на экспорт в митохондрии. При инициации трансляции на втором кодоне АУГ образуется белок длиной 732 остатка, локализующийся в ядре. После отщепления пропоследовательности в митохондриях первая форма ДНК-лигазы I становится тождественной главной ядерной форме. ДНК-лигаза фага Т4 – это мономерный полипептид, катализирующий образование фосфодиэфирной связи между прилегающими 5'-фосфатным (5'-р) и 3'-гидроксильным (3'-ОН) концами цепей ДНК. Его молекулярная масса равна 68 кДа. Типы реакций. Лигирование липких концов. Субстратами в такой реакции представлены двухцепочечными молекулами ДНК, имеющими одноцепочечные, полностью комплементарные липкие концы. Частным случаем такой реакции является лигирование так называемого ника (nick) – разрыва в одной из нитей двухцепочечной ДНК. Лигирование тупых концов.