11. Векторы на основе бактериофагов (м13, λ)

Ответ. Бактериофаги – вирусы, избирательно поражающие бактериальные клетки. Фаговая частица (вирион) состоит из головки и хвоста. Длина хвоста обычно в 2–4 раза больше диаметра головки. В головке содержится генетический материал – одноцепочечная или двуцепочечная РНК или ДНК с ферментом транскриптазой в неактивном состоянии, окруженной белковой или липопротеиновой оболочкой – капсидом. Нуклеиновая кислота и капсид вместе составляют нуклеокапсид. Фаг λ представлен двунитевой линейной ДНК, которая состоит из 48514 п.н. и содержит около 60 генов. На ее концах имеются однонитевые комплементарные участки, состоящие из 12 нуклеотидных остатков (cos-сайты). Они обеспечивают превращение линейной молекулы ДНК в кольцевую. Такие концы молекул получили название липких. Развитие фага λ – это поэтапный процесс, который можно разделить на несколько периодов. Предранний период развития – принимают участие только бактериальные ферменты: ДНК-лигаза (превращает линейную молекулу ДНК в кольцевую) и РНК-полимераза (осуществляет считывание регуляторных генов N и cro c промоторов рL и рR). Ранний период развития фага начинается после синтеза в клетке N-белка, который связывается с РНК-полимеразой в сайтах nutR и nutL, помогая ей преодолевать терминаторы транскрипции. В результате транскрипция, инициированная в предранний период и прерванная в этих сайтах, продолжается, обеспечивая образование продуктов правого и левого ранних оперонов. Правый содержит репликационные гены О и Р, а левый – рекомбинантные гены red. В раннем периоде происходит репликация фаговой ДНК. Для ее инициации нужна транскрипция оrі-сайта с промотора рL и наличие фаговых белков gpО и gpР. Продукт гена О бифункционален: одной частью он "узнает" ori-сайт, располагающийся в самом гене, а другой – взаимодействует с Рпродуктом, который в свою очередь через белок связывается с репликационным комплексом. Поздний период развития фага начинается с транскрипции поздних генов Ѕ – Rz и Nu1 – J с промотора p`R. Гены Nu1 – FII содержат информацию о синтезе белков головки и ее сборке, а гены Z – J обеспечивают образование отростка фага. Сборка головки фага протекает поэтапно. Сначала вокруг центрального ядра, состоящего из белков, собирается сфера из основного белка головки gpE (структура І). Далее центральное ядро удаляется с помощью бактериального продукта GroE, и в образовавшуюся структуру ІІ начинает упаковываться ДНК. На этом этапе белок gpNu1 способствует расширению головки фага (структура III), а белки gpW и gpFII ―вырезают‖ фаговые геномы по cos-сайтам из конкатемерной ДНК. Головка, содержащая ДНК, фиксируется белком gpD (структура ІV), и к ней с помощью белков присоединяется отросток. Сформировавшийся фаг выходит в среду после лизиса клетки, осуществляемого продуктами генов S, R и Rz. Фаг имеет достаточно сложную, но хорошо изученную генетическую организацию. На ДНК фага имеется пять мест расщепления рестриктазой EcoRІ. Для рестриктазы HindIIІ на ДНК бактериофага имеется шесть мест действия, и пять из них в области несущественных генов. Фаг является умеренным фагом, т.е. в зависимости от условий может развиваться в клетке либо по литическому, либо по лизогенному пути. При литическом развитии происходит лизис клеток и образуются инфекционные фаговые частицы, при лизогенном молекула ДНК фага интегрируется в бактериальную хромосому преимущественно в одно место между генами gal и bio и находится в так называемом состоянии профага. Геном фага можно разделить на основные части. Левая часть включает все гены (от Nu1 до J), белковые продукты необходимые для формирования капсидов и упаковки в них молекул фаговой ДНК. Центральная часть, расположенная между генами J и N, несущественна для литического развития фага в клетке-хозяине дикого типа. Эта область генома содержит гены, участвующие в общей рекомбинации фага, сайтспецифической интеграции ДНК фага в бактериальную хромосому и исключении профага из хромосомы. Сайтспецифические рекомбинантные события происходят по особым участкам на ДНК фага и бактериальной хромосомы. Правая часть генома фага содержит все остальные контролирующие элементы, к которым относятся гены, необходимые для репликации фаговой ДНК (О и Р) и для лизиса клеток (Ѕ и К). Значительная часть ДНК (около 20 т. п. н.) несущественна для размножения фага и отвечает за его встраивание в хозяйскую ДНК. В связи с этим возникла идея, что ее можно заменить фрагментом другой ДНК эквивалентного размера. Образующаяся рекомбинантная молекула будет реплицироваться в клетке как ДНК «рекомбинантного" фага, ―вставшего" на литический путь развития. Рекомбинантные молекулы упаковывают в головки бактериофага λ in vitro и после добавления отростков получают инфекционные фаговые частицы. Приготовление экстрактов для осуществления упаковки in vitro ДНК фага λ проводят с помощью двух штаммов E.coli, каждый из которых лизогенен в отношении определенного мутантного штамма фага λ. При упаковке молекулы ДНК длиной менее 38 т.п.н. получается неинфекционная фаговая частица, а фрагменты длиной более 52 т, п. н. не умещаются в головку. Сегменты длиной 50 т. п. н. в линейной молекуле ДНК разделены cos-сайтами, и именно по этим сайтам разрезается молекула, когда очередной сегмент заполняет головку. Разрезание осуществляет фермент, находящийся у входа в головку. Процесс введения рекомбинантной фаговой ДНК со встроенным фрагментом чужеродной генетической информации в клетки-реципиенты основан на естественном природном явлении – трансдукции фаговой ДНК. Трансдукция (лат. transduction – перемещение) представляет собой процесс переноса бактериальной ДНК из одной клетки в другую бактериофагом. Таким образом, трансформация бактериальных клеток с помощью рекомбинантных ДНК на основе фаговой ДНК не требует специальной подготовки клетокреципиентов или какого-либо специального приборного оснащения. Существующие в настоящее время векторные фаги лямбда для каждой конкретной рестриктазы делят на векторы внедрения и векторы замещения. Векторы внедрения имеют на ДНК одно место действия для данной рестриктазы. Если при встройке экзогенного фрагмента ДНК в этот сайт происходит нарушение какого-либо гена исходного фага, селекция гибридных клонов осуществляется как выявление соответствующих фаговых мутантов. Векторы замещения имеют два или больше мест действия рестриктазы на молекуле фаговой ДНК. Заключенные между этими участками фрагменты векторной ДНК замещаются донорными фрагментами ДНК. При этом происходит делеция ряда генов фага, что детектируется соответствующими генетическими методами. Необходимо подчеркнуть, что делетироваться могут только гены, несущественные для литического развития фага. При клонировании и амплификации в векторных плазмидах или производных фага лямбда чужеродные фрагменты ДНК находятся в двухцепочечной форме. Однако в ряде случаев (при определении последовательностей нуклеотидов, выделении комплементарной РНК, направленном мутагенезе и т.д.) необходимо манипулировать с одной цепью ДНК. Нитевидные фаги Е. соlі – М13 наиболее подходят для этой цели. Фаг М13 – нитевидный колифаг, имеющий кольцевой ДНК-геном. Для получения рекомбинантных ДНК используют репликативную форму фага, представляющую собой кольцевую двухнитевую ДНК размером 6400 п.н., в которую вставлен ген lacZ, содержащий полилинкер сайтов для целого ряда рестриктаз. ДНК упакована в трубочку, состоящую из 2700 копий основного оболочечного белка рVIII и закрытую на концах четырьмя или пятью молекулами каждого из четырех минорных оболочечных белков рIII, рVI, рVІІ и рІХ. Рекомбинантные фаги отбирают из зон лизиса бактериального газона, имеющих белый цвет. Нитевидные фаги адсорбируются на F-пилях Е. соІі и поэтому способны инфицировать лишь мужские (F+) бактериальные клетки. Инфекция клеток Е. соІі начинается после адсорбции белка рIII, входящего в состав фаговых частиц, на конце F-пили хозяйской клетки. После этого одноцепочечная ДНК фага, называемая (+) цепью – переносится в цитоплазму клетки. Бактериальные полимеразы осуществляют синтез второй (–) цепи, образуя двухцепочечную репликативную форму фагового генома. Синтез второй цепи инициируется на оrі (–), расположенном в межгенной области ІR. На молекулах репликативнойформы осуществляется транскрипция и последующая трансляция фаговых генов. Белок рІІ вносит разрыв в (+) цепь репликативной формы в участке ori (+), также расположенном в межгенной области ІR. Это приводит к репликации фаговой ДНК по модели катящегося кольца с высвобождением (+)-цепи. По завершении цикла белок рІІ лигирует концы образовавшейся одноцепочечной (+) ДНК. На ранних этапах инфекции новые (+)-цепи служат в качестве матриц для образования дополнительных молекул репликативной формы, однако по мере накопления фагового белка рV, связывающего ДНК, процесс формирования репликативной формы тормозится. Копийность репликативной формы составляет 200–300 молекул на клетку. Для сборки вирионов и их экспорта необходимы клеточные мембраны. Вновь синтезированные оболочечные белки фага встраиваются в плазматическую мембрану. Белки рІІІ и рVIII синтезируются с М-концевыми сигнальными пептидами, которые отщепляются после секреции через плазматическую мембрану С-концевые гидрофобные домены белков остаются в мембране, а N-концевые части выходят в периплазматическое пространство. Белки рІ и рІV образуют мультимерный экспортный канал между внутренней и внешней мембранами. Инициация сборки и экспорта вириона происходит после взаимодействия специфической нуклеотидной последовательности (так называемый сигнал упаковки) в ІR-области (+) ДНК с комплексом рІ-рIV, бактериальным тиоредоксином и минорными оболочечными белками рVII и рІХ. Образуемые вирионы экскретируются через экспортный канал, при этом молекулы белка рV на ДНК постепенно замещаются молекулами белка pVІІІ. Присоединение белков рVІ и рІІІ к концу формируемых вирионов завершает процесс их сборки. Весьма важным свойством этих фагов явилось то, что они не вызывали лизиса бактерий, а только задерживали их рост, в результате чего на бактериальном газоне формировались светлые зоны фаговых бляшек. Длина вирионов зависит от величины фагового генома и может варьировать в широких пределах. Длина частиц гибридного фага увеличивается пропорционально размеру пакующейся ДНК. Образующиеся при инфекции фаговые частицы постоянно экскретируются клетками без лизиса последних, и этот процесс является энергозависимым. За одну генерацию образуется несколько сотен фагов на клетку. Использование векторов на основе фага М13 имеет ряд положительных моментов. Так, одно клонирование дает два вида фагов с однонитевым ДНКгеномом. Каждый вид фага содержит только одну из нитей вставки ДНК, которые могут находиться в разных ориентациях. В связи с этим, клонирование с использованием фага М13 удобно для создания однонитевых ДНК-зондов и секвенирования ДНК. Этапом совершенствования данного вектора для молекулярного клонирования было добавление во фрагмент гена β-галактозидазы, обозначаемого как LacZ', уникального сайта рестрикционной эндонуклеазы EcoRI, осуществленное с помощью химического мутагенеза, в результате чего образовались вектора М13тр2 и М13трЗ. Дальнейшие улучшения векторов на основе одноцепочечного фага М13 привели к последовательному добавлению уникальных сайтов узнавания для рестрикционных эндонуклеаз HindIII и ВатHI. Первые сконструированные полилинкеры представляли собой симметричные последовательности, несущие по два сайта узнавания некоторых рестрикционных эндонуклеаз, как, например, EcoRI-ВатHI-SalI-PstI-SalI-BamHIEcoRI. Создание впоследствии асимметричных полилинкеров в векторе М13mp9 или ему подобных, привело к возможности использования для выделения вставки одновременно двух разных ферментов, узнающих отличающиеся последовательности и образующих как 5', так и 3'-выступающие концы, что было необходимо или для мечения только одного из них, или переклонирования в другом векторе в заранее заданной ориентации. Последовательности полилинкеров были сконструированы таким образом, что не нарушали рамку считывания NH2-терминального фрагмента β-галактозидазы, но при клонировании какого-либо фрагмента ДНК функциональная целостность фермента нарушалась и при использовании специального хромогенного субстрата 5-бромо-4-хлоро-галактозида (x-gal) и индуктора изопропил-(3-тиогалактозида (ИПТГ) легко выявлялись рекомбинантные бактериофаги, несущие вставки. Отдельные случаи сохранения голубого окрашивания рекомбинантными фаговыми бляшками, равно как плазмидами и фагмидами, происходят вследствие клонирования небольших вставок с количеством нуклеотидов кратным 3, что не приводит к нарушению рамки считывания гена βгалактозидазы (конечно, при условии отсутствия терминирующих кодонов во вставке). В течение ряда лет была сконструирована целая серия одноцепочечных векторов М13тр, отличающихся только своими полилинкерами (М13тр6, М13тр7, М13тр8, М13тр9 и др.). Следует отметить, что до недавнего времени продолжались работы по улучшению векторов данного семейства и им подобных. Все это было вызвано тем, что одноцепочечные вектора на основе фага М13 оказались крайне удобными при выполнении проектов по секвенированию фрагментов ДНК ферментативным методом Сэнгера.