31. Сайт-специфический мутагенез

Ответ. Сайт-направленный мутагенез позволяет одновременно заменять не только единичный нуклеотид или их группу, но и образовывать делецию или наоборот вставку из нескольких нуклеотидов, причем их протяженность может быть довольно большой и зависящей, главным образом, от общей длины синтезированного олигонуклеотида. Олигонуклеотид-направленный (сайт-специфический) мутагенез – это один из наиболее простых методов внесения точковых мутаций в клонированный ген. Для его осуществления необходимо знать: точную нуклеотидную последовательность той области ДНК, которая соответствует мРНК-кодону, подлежащему изменению; характер аминокислотных замен. Обычно встраивают ген-мишень в двухцепочечную форму вектора на основе бактериофага М13. Сначала выделяют одноцепочечную форму вектора (плюс-цепь М13) и смешивают ее с синтетическим олигонуклеотидом, в точности комплиментарным – за исключением одного нуклеотида – нужному сегменту клонированного гена. Этот отличающийся (т. е. неспаривающийся) нуклеотид соответствует тому нуклеотиду кодона мРНК, который необходимо изменить. Олигонуклеотид будет гибридизоваться с комплементарным участком клонированного гена в том случае, если: он добавлен в количестве, во много раз превышающем количество ДНК М13; неспаривающийся нуклеотид находится примерно посередине олигонуклеотида; отжиг проводят при низкой температуре и высокой ионной силе. 3'-конеп спарившегося олигонуклеотида служит затравкой для инициации синтеза ДНК, а интактная цепь ДНК М13 – матрицей. Репликация осуществляется с помощью фрагмента Кленова ДНКполимеразы I Escherichia coli при наличии в среде четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, а присоединение последнего нуклеотида синтезированной цепи к 5'-концу затравки обеспечивает ДНК-лигаза фага Т4. Однако, in vitro синтез ДНК редко идет до конца, и частично двухцепочечные молекулы приходится отделять от нормальных центрифугированием в градиенте сахарозы. Полностью двухцепочечными молекулами ДНК фага М13, содержащими, однако, некомплементарные нуклеотиды, трансформируют клетки Е. coli. В последних образуются фаговые частицы, что, в конечном счете, приводит к лизису клеток и образованию бляшек. Поскольку репликация идет по полуконсервативному механизму, половина популяции образующихся фаговых частиц должна содержать ДНК дикого типа, а половина – мутантную ДНК со специфической нуклеотидной заменой. Частицы, содержащие только мутантный ген, идентифицируют при помощи ДНК-гибридизации в жестких условиях, используя в качестве зонда исходный олигонуклеотид. Мутантный ген вырезают и встраивают в какой-либо экспрессирующий Е. соli-вектор. Мутантный белок синтезируют в Е. coli и очищают.

32. Направленный мутагенез с помощью олигонуклеотидов

Ответ. Основной недостаток олигонуклеотид-направленного мутагенеза с использованием фага М13 – большое число процедур. Чтобы выделить мутантную форму нужного гена, приходится затратить много времени. В качестве альтернативы системе с использованием фага М13 было разработано множество других подходов, основанных на применении плазмидных ДНК. Это позволяет обойтись без переноса интересующего исследователя гена из плазмиды в фаговую ДНК, а после завершения мутагенеза – обратно в плазмиду. Один из этих подходов включает встраивание ДНК в плазмидный вектор, который несет функциональный ген устойчивости к тетрациклину и неактивный ген устойчивости к ампициллину; в середине последнего заменен один нуклеотид. Клетки Е. coli трансформируют вектором, несущим ДНК-мишень, и двухцепочечную плазмидную ДНК денатурируют щелочью с тем, чтобы получить одноцепочечные кольцевые молекулы. Денатурированную ДНК отжигают с тремя разными олигонуклеотидами. Один из них предназначен для внесения изменений в клонированную ДНК-мишень, второй – для устранения мутации в гене устойчивости к ампициллину, третий – для замены одного нуклеотида в гене устойчивости к тетрациклину с тем, чтобы инактивировать этот ген. В реакционную смесь добавляют четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата и ДНК-полимеразу Т4, функционирующую аналогично фрагменту Кленова ДНК-полимеразы I Е. coli. Гибридизовавшиеся олигонуклеотиды служат затравками для синтеза ДНК, а интактная кольцевая молекула НК – матрицей. Одноцепочечные разрывы в новосинтезированной цепи зашиваются с помощью ДНК-лигазы Т4. По окончании синтеза и лигирования продуктами реакции трансформируют клетки Е. coli. Трансформантов отбирают по признаку устойчивости к ампициллину и чувствительности к тетрациклину. Случайный мутагенез с использованием «вырожденных» олигонуклеотидных праймеров. Такие «вырожденные» олигонуклеотиды обычно получают, добавляя в автоматический синтезатор ДНК на определенном этапе, когда к цепи должен присоединяться специфический нуклеотид, небольшое количество (до нескольких процентов) трех других нуклеотидов. В результате получается гетерогенный по одному сайту набор олигонуклеотидных праймеров, с помощью которых можно получить соответствующий набор мутантных геновмишеней с нуклеотидными заменами в специфическом сайте. Этот подход имеет два преимущества: не нужно в точности знать, какую роль играет тот или иной аминокислотный остаток в функционировании белка; поскольку в данном сайте происходят разные аминокислотные замены, могут случайно синтезироваться белки с разнообразными интересными и полезными свойствами. Конечно, если ни один из образующихся белков не обладает нужными свойствами, приходится все начинать сначала, синтезировав новый набор «вырожденных» праймеров, комплементарных другой области гена.