13. Векторы на основе Тi-плазмид

Ответ. Бактерии рода Agrobacterium иногда называют природными генными инженерами за их способность переносить свою плазмидную ДНК в клетки зараженных растений, интегрировать ее в геном организма-хозяина и вызывать стабильную трансформацию этих клеток введенными генами. Все они приводят к образованию у двудольных растений корончатых галлов – трансформация индуцирует образование опухолей, похожих на раковые. Инфекционным агентом является так называемая Ti-плазмида (tumor-inducing plasmid) в 200–250 тнп, которая содержит все гены, необходимые для инфекционного процесса. Галлы называют дедифференцированными. Опухолевая ткань, которую они образуют, аморфна. Растения, на которых образовались галлы, начинают отставать в росте, часто подсыхают, урожайность их резко падает, а чувствительность к неблагоприятным условиям растет. Болезнь поражает свыше 600 видов почти исключительно двудольных. Опухолевое перерождение растительных клеток – процесс стойкий, наследующийся в потомстве. В культивируемых вне организма опухолевых клетках их характерное свойство передается из поколения в поколение в течение наблюдений, длящихся свыше 20 лет. Несмотря на недостатки, уникальные биологические свойства Тi-плазмиды делают ее идеальным вектором для переноса генов. Она имеет широкий круг хозяев, встраивает ДНК в состав хромосомы, где она реплицируется и большая ее часть транслируется с образованием белка. Однако из-за больших размеров (от 200 до 800 кб) манипуляции с Тi-плазмиды осложнены, вставить ген в плазмиду традиционными методами становится невозможным. Несмотря на это сконструировано несколько векторов для растительных клеток. Все векторы на основе Тi-плазмид организованы подобно и имеют следующие элементы. Селективный маркерный ген, например, ген неомицинфосфотрансферазы, обеспечивающий устойчивость трансформованних растительных клеток к канамицину. Сайт инициации репликации, позволяющий плазмиде реплицироваться в E.coli. Права фланкирующих последовательность Т-ДНК, которая необходима для интеграции Т-ДНК в клеточную ДНК растений. Полилинкер (множественный сайт клонирования) для встраивания гена в область между границами Т-ДНК. В корончатых галлах разные штаммы Agrobacterium tumefaciens индуцируют синтез разных опинов (октопина, нопалина, агропина), в соответствии с чем различают октопиновые или нопалиновые Ti-плазмиды. После присоединения Agrobacterium, несущей Ti-плазмиду, к растительной клетке, часть плазмиды, индуцирующей развитие опухоли (Т-ДНК (transferred DNA), 12–24 тнп в зависимости от штамма), транспортируется в клетку. При этом Т-ДНК транспортируется в одноцепочечной форме, и именно в такой форме она встраивается в хромосомную ДНК растения. С переносимой Т-ДНК остаются связанными два кодируемых Ti-плазмидой белка, способствующие ее вырезанию, и третий белок покрывает оболочкой переносимую одноцепочечную ДНК, предохраняя от деградации. Все белки содержат сигнал ядерной локализации (NLS), который обеспечивает перенос Т-комплекса из цитоплазмы в ядро растительной клетки. Введенные гены Agrobacterium активируются в растении, программируя разрастание ткани (формируется галл), которая начинает синтезировать и секретировать опины. Опины – продукты конденсации амино- и кетокислот или аминокислот и сахаров Agrobacterium – используют как источник углерода и азота, причем другие исследованные почвенные микроорганизмы не способны использовать данные соединения. Введение генов непосредственно с помощью Ti-плазмид не используется, поскольку приводит к образованию опухолевых клеток, из которых невозможно получить целое растение. Для этих целей применяют небольшие векторные молекулы на основе Ti-плазмид с удаленными онкогенами из переносимой Тобласти, которая ограничена 24-нуклеотидными повторами. Вместо онкогенов встраивают последовательности клонируемой чужеродной ДНК и селективный маркер. Наличие сайта инициации репликации E. coli в составе Ti-вектора позволяет проводить в кишечной палочке все стадии сборки генетической конструкции. В качестве селективного маркера используют гены устойчивости к антибиотикам или гербицидам, которые дают возможность отбирать трансформированные клетки растений. После введения целевой ДНК рекомбинантным Ti-вектором трансформируют клетки агробактерий, несущих модифицированную Ti-плазмиду-помощницу с удаленной Т-областью, но содержащую все необходимое для переноса в растительные клетки T-ДНК части с рекомбинантной плазмиды. Такие вектора получили название бинарных, поскольку только вместе с плазмидой-помощницей они составляют пару из двух элементов для полноценного функционирования системы переноса генов в растительную клетку с помощью агробактерий. Плазмида-Ti представляет собой уникальное явление. Есть основание предполагать, что она является природной химерой, поскольку несет два набора генов: один набор экспрессируется в растения, а другой — в бактериальной клетке. Регуляторные элементы генов, расположенных на сегменте Т-ДНК, предназначены для функционирования в растительной клетке, тогда как остальные гены Ti-плазмиды находятся под контролем бактериальных промоторов. Уникальные биологические свойства Ti-плазмиды делают ее идеальным природным вектором для переноса генов. Ti-Плазмида имеет широкий круг хозяев, встраивает Т-ДНК в хромосомы растений, где она может реплицироваться, и ее гены транслируются с образованием белка. Существенно также, что границы Т-ДНК обозначены прямыми повторяющимися последовательностями длиной 25 нуклеотидных пар, и любой фрагмент чужеродной ДНК, вставленный между этими повторами, будет перенесен в растительную клетку. Однако манипуляции с Ti-плазмидой затруднены из-за больших размеров, вставить ген в плазмиду традиционными методами не представляется возможным. Поэтому Ti-плазмида была модифицирована генноинженерными путями, и на ее основе были получены векторы для трансформации растений.