10. Векторы на основе репликонов бактериальных плазмид (pBr322, puc18)

Ответ. pBR322 – плазмида, используемая в бактериях E. coli как вектор клонирования. Создана в 1977 году мексиканскими биологами Франциско Боливаром и Раймондом Родригесом. рBR322 содержит 4361 нуклеотидную пару и состоит из участка репликации ori (взят из плазмиды pMB1); гена ampR, кодирующего белок, обеспечивающий устойчивость к ампициллину (взят из плазмиды RSF2124) и гена tetR, обеспечивающего устойчивость к тетрациклину (взят из плазмиды pSC101). Плазмида содержит уникальные сайты рестрикции для более чем 40 рестриктаз. 11 из этих 40 сайтов находятся внутри гена tetR, причѐм 2 сайта (HindIII и ClaI) расположены внутри промотора этого гена. 6 сайтов находятся внутри гена ampR. Участок репликации ori, заимствованный из плазмиды pMB1, сходен по структуре с ColE1. Он кодирует две РНК (RNA I и RNA II) и один белок (Rom или Rop). Нумерацию нуклеотидных пар принято начинать с центральной линии уникального сайта рестрикции EcoRI в направлении гена tet. Ген устойчивости к ампициллину – пенициллиновая бета-лактамаза (англ. penicillin beta-lactamase) с промотерами P1 и P3. P3 является естественным промотором, а P1 создан искусственно лигированием двух различных фрагментов ДНК. Промотер P2 аналогичен P1, однако расположен на противоположной стороне плазмиды и инициирует транскрипцию в направлении гена устойчивости к тетрациклину. Клетки E.coli, содержащие pBR322, выращивают на питательных средах c ампициллином или тетрациклином, либо с обоими антибиотиками. Если встроить какой-либо фрагмент ДНК по рестрикционному сайту, расположенному в одном из маркерных генов, то этот ген инактивируется. Так, при встраивании ДНК, например по сайту для эндонуклеазы рестрикции PstI, расположенному на участке, кодирующем устойчивость к ампициллину, не может синтезироваться белок, обеспечивающий рост клеток, содержащих такую рекомбинантную ДНК, на средах с ампициллином. Такие клетки способны расти на средах, содержащих тетрациклин, но не ампициллин. И наоборот, вставки сегментов ДНК по участкам узнавания ферментов, расположенных в гене устойчивости к тетрациклину, например HindIII или BamHI, оставляют возможность выживания клеток только на средах с ампицллином. При любой локализации вставки в молекуле вектора происходит отбор только тех бактериальных колоний, которые содержат рекомбинантные плазмидные ДНК. Клонирование рекомбинантных ДНК с помощью плазмидного вектора pBR322. ДНК pBR322 разрезают эндонуклеазой рестрикции PstI в участке, определяющем устойчивость к ампициллину. Фрагменты донорной ДНК, также полученные с помощью PstI и имеющие липкие концы, как и линеаризованный вектор pBR322, с помощью ДНК-лигазы сшивают с векторной ДНК. Следствием образования такой конструкции является деструктурирование гена, обеспечивающего устойчивость к ампициллину. Таким образом, созданная рекомбинантная ДНК при введении в клетки E.coli не сможет обеспечить им выживание на среде с ампициллином. Клетки E.coli трансформируют рекомбинантной ДНК. Суспензию клеток после проведения процедуры трансформации высевают на чашки с агаром и питательной средой, содержащей антибиотик тетрациклин. На этом этапе происходит селекция, т.е. отбор клеток, которые способны расти на среде с тетрациклином. Выросшие на этом агаре клетки содержат рекомбинантную ДНК и ДНК pBR322, в которую не встроилась вставка донорной ДНК, т.е. восстановилась первоначальная структура вектора. Индивидуальные колонии клеток E.coli, выросшие на чашке с тетрациклином пересевают на чашки две чашки, одна из которых содержит агар с ампициллином, а вторая – с тетрациклином. Клетки, содержащие рекомбинантную плазмидную ДНК, растут только на агаре с тетрациклином, поскольку ген, обеспечивающий устойчивость к ампициллину у них деструктурирован за счет встраивания донорной ДНК. В то время как клетки с исходной, т.е. восстановленной векторной ДНК pBR322 растут на обеих чашках, поскольку гены устойчивости к обоим антибиотикам находятся в нативном, т.е. в исходном состоянии. Из клеток отобранных клонов E.coli экстрагируют плазмидную ДНК и анализируют ее структуру. Плазмиды pUC18 и pUC19 представляют собой чрезвычайно удобные для клонирования векторы. Основное их преимущество – наличие полилинкера, включающего 13 уникальных сайтов рестрикции внутри α-фрагмента гена β-галактозидазы, что значительно облегчает селекцию рекомбинантных клонов, которые могут быть отобраны на чашках с IPTG и X-gal как бесцветные колонии на фоне окрашенных нерекомбинантных. Плазмида PUC18 представляет собой кольцевую молекулу ДНК, состоящую из нескольких сотен или тысяч пар оснований. Естественно встречающиеся плазмиды являются вирусами бактерий. Искусственная плазмида pUC18 была генетически сконструирована так, чтобы включать ген устойчивости к антибиотикам к ампициллину (ampR) и ген (и его промотор) для фермента бета-галактозидазы (lacZ). Ген lacZ содержит полилинкерную область, с рядом уникальных сайтов рестрикции, больше нигде не найденных в плазмиде. Соприкосновение с любой из этих эндонуклеаз приведет к одному «разрезу», который линеаризует круговую плазмидную ДНК и позволит ему рекомбинировать с чужеродной ДНК, которая была разрезана той же эндонуклеазой.