21. Секвенирование днк

Ответ. Секвенирование (ДНК, РНК) – это определение их аминокислотной или нуклеотидной последовательности. В результате секвенирования получают формальное описание первичной структуры линейной макромолекулы в виде последовательности мономеров в текстовом виде. Секвенирование – это общее название методов, которые позволяют установить последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК. В настоящее время нет ни одного метода секвенирования, который бы работал для молекулы ДНК целиком; все они устроены так: сначала готовится большое число небольших участков ДНК (многократно клонируется молекула ДНК и «разрезается» в случайных местах), а потом читается каждый участок по отдельности. Первым методом секвенирования, который ученые сумели применить для обработки целых геномов (в том числе генома человека), стало секвенирование по Сэнгеру. Смысл таков: участок ДНК клонируется, после чего полученная смесь делится на четыре части. Каждая часть помещается в активную среду, где присутствуют. ДНК-полимераза, которая занимается репликацией. Праймеры, необходимые для начала процесса репликации. Смесь всех четырѐх нуклеотидов, которые будут служить «кирпичиками» для строительства новых копий ДНК. И, главное, специальные вариации одного из нуклеотидов (ровно один вид нуклеотидов для каждой части), которые прекращают дальнейшее копирование молекулы ДНК. Процесс практически идентичен клонированию ДНК. Разница только в том, что теперь в один из нуклеотидов подмешаны «ложные» нуклеотиды; они могут образовать точно такую же водородную связь, но не могут продолжить свою нить дальше. В результате в каждой части образуется большое число копий префиксов исследуемого участка ДНК, которые имеют разную длину, но всегда заканчиваются на одну и ту же букву – в зависимости от того, когда повезет взять в процесс клонирования «ложный» нуклеотид. В сумме, в четырех пробирках мы получили все возможные префиксы интересующего нас участка. Это значит, что если мы сможем просто измерить длину каждого префикса (точнее говоря, даже не измерить, а просто упорядочить, узнав, кто из них длиннее), то мы сможем узнать и последовательность тоже.

22. Полимеразная цепная реакция (пцр)

Ответ. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий многократно избирательно копировать определенные участки нуклеиновой кислоты (ДНК) при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. Открытие термостабильной Taq ДНК-полимеразы у термофильных бактерий Thermus aquaticus, разработка программируемых термостатов (термоциклеров или амплификаторов), внедрение в практику готовых наборов (китов) для ПЦР и многое другое привело к тому, что в настоящее время эта технология является одним из наиболее распространенных и востребованных методов молекулярной биологии, который широко используется как в фундаментальных, так и в прикладных областяхнауки (от клонирования генов доДНК-диагностики заболеваний человека и других живых организмов). Сама по себе вся технология ПЦР состоит из трех стадий: стадия I – подготовка матрицы, которая включает выделение и очистку ДНК или РНК, определение их концентрации, оценку качества матрицы, синтез комплементарной ДНК (кДНК) (в том случае, когда в качестве исходной матрицы выступает РНК), концентрирование (при необходимости повышения чувствительности детекции); стадия II– амплификация или собственно ПЦР; стадия III – разделение и визуализация (детекция) продуктов реакции с помощью аналитического гель-электрофореза или иных инструментальных методов разделения и детекции нуклеиновых кислот. Молекулярные маркеры (синоним – ДНК-маркеры) – это генетические маркеры, анализируемые на уровне ДНК. ДНК-маркеры являются третьим поколением генетических маркеров. Им предшествовали белковые маркеры, а еще ранее – классические генетические маркеры. К ним применимы термины классической генетики, такие как локус, аллель, доминантный и кодоминантный тип наследования. Аллели маркерных локусов представляют собой различные формы (нуклеотидные последовательности, отличающиеся по длине и/или по нуклеотидным заменам) одного и того же маркера, расположенные в одинаковых участках (локусах) гомологичных хромосом. Если метод анализа маркера позволяет выявлять оба аллеля, говорят о кодоминантном типе наследования данного маркера, если выявляется только один аллель – о доминантном наследовании.