12. Векторы на основе вирусов животных

Ответ. Вирус SV40 относиться к роду Polyomavirus семейства Polyomaviridae и является мелким вирусом, способным реплицироваться в клетке-хозяине. Двунитевая кольцевая ДНК вируса содержит 5243 п.н. Отсчет нуклеотидов ведут по часовой стрелке от единственного BglI-сайта, расположенного в точке начала репликации. ДНК размножается вегетативно или в интегрированном в хромосомы состоянии. Наиболее эффективно вирус размножается на первичных или перевиваемых линиях клеток почки африканской зеленой мартышки. Гены вируса SV40 в значительной степени перекрываются: область начала репликации перекрывается с промоторными последовательностями, направляющими транскрипцию. Ранний промотор вируса содержит характерный TATA – бокс на расстоянии 115 п.н. от точки инициации, представляющий три прямых повтора последовательности (21 п.н.). Также с этой областью связывается клеточный фактор SP1, который формирует комплекс, необходимый для транскрипции РНК-полимеразой II. В процессе ранней транскрипции происходит синтез пре-мРНК, в результате альтернативного сплайсинга из нее формируются молекулы зрелых мРНК, кодирующие Т-антигены. Т-антиген (фосфопротеин) является единственным белком вируса SV40, который необходим для эффективной репликации вирусной ДНК в инфицированных клетках. Показано, что он обладает ДНК-хеликазной активностью. Это позволяет вирусу преодолевать существующий в нормальных клетках контроль репликации ДНК в течение клеточного цикла. Эндогенная хеликаза клетки предотвращает реинициацию репликации вновь синтезированной ДНК до тех пор, пока не завершится репликация всей хромосомы. Вирусная Т-хеликаза, входящая в репликативный ферментный комплекс SV40, отличается от клеточной тем, что обусловливает эффективную многократную инициацию репликации вирусной ДНК на протяжении одного цикла деления клетки. Т-антиген осуществляет авторегуляцию экспрессии своего гена. При инфицировании культур, непермиссивных для продуктивного развития SV40, вирусная ДНК встраивается в геном клетки, причем во множественных копиях. Интеграция иногда может сопровождаться и внутренними перестройками вирусной ДНК. Внедрение вирусного генома в хромосомную ДНК реципиентной клетки не является сайтспецифическим. Малый t-антиген (размер 174 АК) в зависимости от используемой культуры клеток или абсолютно необходим для неопластической трансформации наряду с Т-антигеном, или усиливает его действие, или не требуется вовсе. Из-за насыщенности генетической структуры вируса SV40 лишь в ограниченном числе мест на его ДНК могут происходить незначительные перестройки типа вставок или делеций без потери жизнеспособности вируса. При встройке в ДНК данного вируса чужеродного фрагмента по любому из уникальных мест гидролиза рестриктазами будет происходить нарушение той или иной функции,т.е. гибридные вирусы SV40 будут дефектны. Чтобы гибридная ДНК могла упаковаться в вирусный капсид, ее размер должен составлять 70–100% генома вируса. Поэтому для получения гибридного вирусного потомства необходимо чужеродный фрагмент ДНК встраивать в молекулу вирусной ДНК, у которой предварительно с помощью рестриктаз делетирован определенный район. Такие векторы являются векторами замещения. Обязательное условие при конструировании гибридных вирусов – сохранение неповрежденной области начала репликации вирусной ДНК. Нарушенные при встройке в векторную ДНК другие вирусные функции необходимо комплементировать с помощью вируса-помощника. Молекулярные векторы данного типа на основе ДНК вируса SV40 называют литическими векторами. Для встройки фрагментов ДНК в область поздних генов вируса SV40 используются рестриктазы HpaII, EcoRI, BamHI, HaelI и другие ферменты рестрикции, имеющие уникальные места гидролиза на вирусной ДНК, а также Hhal, имеющую два участка гидролиза. ДНК SVGT5 может успешно применяться в качестве экспрессирующего литического вектора при клонировании чужеродных кодирующих последовательностей. В конструируемых генах гибридных вирусов SV40 эффективно используются сигналы инициации и терминации транскрипции, сплайсинга и полиаденилирования поздней мРНК вируса. Доказано, что в различных клетках млекопитающих механизмы инициации транскрипции генов, сплайсинга и полиаденилирования мРНК трансляции и секреции белков во многом схожи. Кроме того, обнаружено, что синтезируемые в клетках животных чужеродные белки могут подвергаться гликозилированию. К недостаткам данных литических векторов необходимо отнести прежде всего то, что активная экспрессия клонированных генов происходит лишь на позднем этапе цикла развития гибридного вируса, который завершается лизисом клеток. После интеграции гибридной вирусной ДНК в геном непермиссивных клеток промотор поздней транскрипции вируса SV40 не функционирует, и в результате экспрессия клонированного гена может прекратиться. В связи с этим интерес представляет разработка литических векторов замещения ранних генов вируса SV40. Для репликации ДНК таких гибридов в инфицированных клетках необходимо наличие Т-антигена. Это достигается совместной инфекцией гибридным вирусом и вирусом-помощником, дефектным по поздним функциям. При введении клонированных генов в клетки млекопитающих в процессе генетической трансформации множественные копии этих генов интегрируются в геном клетки. У независимо отобранных трансформированных клеток места интеграции чужеродной ДНК в хромосомы различаются. Это может приводить к тому, что уровень экспрессии введенных генов в разных клонах будет варьировать за счет влияния прилегающих участков хромосом (эффект положения гена). Одна из возможностей преодолеть данные затруднения возникла в 1981 г. после создания векторов на основе ДНК вируса папилломы быка типа 1 (BPV-1). В конце 1970-х гг. было обнаружено, что ряд вирусов рода Papillomavirus семейства Papillomaviridae, вызывающих образование фибропапиллом у своих природных хозяев, онкогенны для хомяков, а вирус папилломы быка способен обусловливать морфологическую трансформацию культур клеток мышей, крыс и хомяков. Причем клетки, трансформированные BPV-1, содержат в ядре до 200–300 копий двухцепочечной кольцевой вирусной ДНК во внехромосомном состоянии, и для установления и поддержания трансформированного состояния клеток не требуется интеграции вирусного генома в хромосомную ДНК. Более того, в трансформированных клетках BPV-1 персистирует исключительно в виде кольцевой ДНК и вирусные частицы не образуются. Для упрощения генно-инженерных манипуляций были созданы челночные векторы на основе ДНК вируса папилломы и плазмид. Такие векторы способны эффективно реплицироваться и сохраняться как в клетках млекопитающих, так и в бактериях. В первых подобных работах полную копию ДНК вируса BPV-1 или ВРУ69Т-фрагмент объединяли с плазмидой pBR322. В обоих случаях трансформирующая активность гибридных ДНК была снижена более чем в 100 раз по сравнению с исходной ДНК вируса. Выщепление из гибридной ДНК с помощью рестриктаз последовательности pBR322 приводило к восстановлению трансформирующей активности вирусной ДНК. Это позволило предположить, что тот же участок плазмиды pBR322, который подавляет в цис-положении репликацию ДНК вируса SV40, ингибирует репликацию ДНК вируса папилломы быка. Поэтому для получения челночных векторов полную копию ДНК вируса BPV-1, расщепленную рестриктазой BamHl, соединяли с делеционными производными плазмиды pBR322 типа pML2, у которых удален участок ингибирования репликации (глушитель транскрипции) вирусных ДНК. Такие гибридные ДНК эффективно трансформировали клетки мыши, реплицировались в них как стабильные, неинтегрированные, многокопийные (до 100 копий на клетку) плазмиды. Сконструированные челночные плазмиды использовали для клонирования генов и изучения их экспрессии в клетках млекопитающих. Гибридные молекулы ДНК, созданные на основе челночных векторов BPV-1, вследствие их внехромосомной локализации можно легко перенести из клеток животных в бактерии путем трансформации компетентных клеток Е. coli суммарным препаратом ДНК трансформированных BPV-1 культур клеток. Это позволяет достаточно просто проводить структурный анализ гибридных плазмид после репликации их в эукариотических клетках. Одним из ограничений рассмотренной векторной системы следует признать то, что селективным маркером является фенотип онкогенно трансформированных клеток. Только линии клеток, чувствительные к трансформации, обусловливаемой вирусом папилломы быка, являются подходящими реципиентами для сегментов чужеродной ДНК, объединенных с трансформирующей областью BPV-1. Соединение доминантных селективных маркеров с ДНК вируса папилломы позволяет расширить круг хозяев для этой векторной системы. Преимуществом использования ретровирусов как векторов состоит в том, что клетки не погибают и в течение многих генераций продуцируют вирусы, что дает возможность создавать продуценты, постоянно синтезирующие определенный продукт. Вмешательство в геном ретровирусов приводит к его дефектности. Однако если в нем сохранить концевые повторы LTR и сайты P, Pu, psi и S, то недостающие функции рекомбинантного вируса могут быть компенсированы продуктами, поставляемыми вирусом-помощником или специальными линиями клеток. Конструирование рекомбинантных ретровирусных геномов ведут в клетках E. coli с помощью плазмидных векторов, в которых клонирован провирус. В таких векторах селективный и целевой гены обычно находятся под вирусным промотором, расположенном в левом LTR. Селективный ген легко интегрировать вместо локуса env. Рекомбинантной плазмидой трансформируют подходящую линию животных клеток, одновременно инфицируя еѐ вирусомпомощником. В плазмиде будет транскриьбироваться только вирусная часть с клонированными генами. Аденовирусы удобны в качестве векторов, так как имеют широкий круг хозяев, слишком быстро размножаются с образованием множества копий вируса, обеспечивают высокий уровень экспресии и их ДНК не интегрируется в хромосому. У них очень сложная система транскрипции ранних и поздних генов, что сужает возможность замещения вирусных генов на чужеродные. Удобен для этого ген Е1, отвечающий за репликацию вирусной ДНК. В векторе он замещен на экспрессионную кассету, вмещающую до 6–8 кб чужДНК. Создана линия клеток, в которой данный локус конститутивно экспрессируется. В таких клетках дефектные аденовирусы способны реплицироваться и формировать зрелые вирионы. Векторы на основе бакуловирусов. Данные вирусы инфицируют насекомых. При своем развитии они образуют в клеточном ядре белковые тела включения, состоящие в основном из белка полиэдрина, ген которого обладает мощным промотором. Именно этот промотор используют для экспрессии в клетках насекомых клонируемых генов. Геном бакуловирусов имеет достаточно большой размер. Для работы с вирусом ядерного полиэдроза (AcMNPV) Autographa california предлагает в качестве вспомогательного вектора плазмиду pBlueBacHis2 с вариантами А, В и С для разных рамок считывания. Экспрессионная кассета, включающая в себя информацию о полигистидиновом тракте, сайте действия энтерокиназы ЕК и эпитопе Epi, а также сайт поликлонирования, подчинена промотору гена полиэдрина. С одной стороны кассета фланкирована вирусным геном ORF1629, а с другой – 5‘-частью генов lacZ, управляемого вирусным промотором. В вирусной ДНК рядом с геном ORF1629 внедрена 3‘-часть гена lacZ, частично перекрывающаяся с его 5‘-частью, находящейся в плазмиде. Экспрессионная кассета, содержащая клонируемый ген, оказывается в составе вирусной ДНК после ее гомологической рекомбинации с плазмидой in vivo. Рекомбинантный вирус отыскивается по голубой окраске негативных колоний, являющейся следствием активности восстановленного гена lacZ. Система обеспечивает эффективную очистку синтезированных белков и получение их в индивидуальной форме.