16. Получение библиотеки днк с помощью вирусных или плазмидных векторов

Ответ. Для создания банка генов, следует клонировать как можно более крупные фрагменты ДНК. Однако чем длиннее фрагменты, тем труднее с ними манипулировать и сложнее их анализировать. Достаточно рутинны процедуры с молекулами ДНК размером до 50 т.п.н. Работа с молекулами ДНК длиной свыше 100 т.п.н. требует специальных методов и приборов. Выбор вектора определяется необходимым размером вставки, который в свою очередь зависит от цели создания банка. Наиболее распространенная задача молекулярных биологов – поиск и анализ каких-либо конкретных генов. В большинстве случаев для этого достаточно иметь геномные библиотеки, созданные с помощью фаговых векторов AEMBL3, AORF8 и AFIX, а также с помощью фазмид типа ApMYF131. Размер вставки при этом не превышает 22 т.п.н. В некоторых случаях (сложная регуляторная система, много интронов) используют космиды, имеющие повышенную емкость (45 т.п.н.), в частности, космиды c2RB и Lorist. Однако приходится учитывать трудности, в частности: космиды более чувствительны к качеству ДНК, взятой для клонирования; упаковка в головки in vitro рекомбинантных космид менее эффективна, чем фаговой ДНК; процесс селекции трансформантов, содержащих рекомбинантные космиды, более затруднен, чем прямой отбор рекомбинантных фагов; банк в виде бактериальных клонов труднее хранить, чем фаговый; скрининг легче проводить с фаговыми клонами, чем с бактериальными. Поэтому космиды применяют только в случаях, когда указанный размер вставки действительно необходим. Отдельная задача – полный анализ генома, его физическое картирование и секвенирование. Здесь приходится начинать с клонирования как можно более крупных фрагментов с тем, чтобы облегчить процесс составления карты. Для этого используют дрожжевые векторы YAC. Они незаменимы также при анализе гигантских генов, таких как ген дистрофина, размер которого 1800 т.п.н. Перспективны векторы BAC, основанные на использовании ori-сайта плазмиды F и позволяющие клонировать фрагменты ДНК длиной до 300 т.п.н. Промежуточное положение занимают векторы, основанные на репликоне и системе упаковки фага P1. ДНК млекопитающих обычно выделяют обработкой клеток протеиназой К в присутствии ЭДТА и SDS с последующей экстракцией фенолом. Молекулы ДНК длиной более 200 т.п.н. получают формамидным методом. Разработаны методы выделения ДНК со средним размером несколько миллионов пар нуклеотидов. В этих случаях лизис клеток и выделение ДНК ведут в агарозном геле. Для получения геномных библиотек млекопитающих требуется около 200 мкг ДНК. Необходимость случайного дробления ДНК понятна. При этом, во-первых, нет опасности, что какой-нибудь ген не будет представлен в банке из-за его систематического расщепления. Во-вторых, обеспечивается перекрывание клонируемых фрагментов, что важно для проведения "прогулки" по хромосоме, т.е. для перехода от одного фрагмента к соседнему с ним. Однако эффективность клонирования фрагментов ДНК, полученных механическим дроблением, оказалась недостаточной для конструирования представительных библиотек из-за необходимости проведения дополнительных ферментативных обработок для их лигирования.