27. Приготовление матриц для секвенирования днк

Ответ. Поскольку в основе метода ферментативного секвенирования лежит построение новой комплементарной цепи ДНК по уже имеющейся, то большое значение приобретает подготовка молекул ДНК для осуществления этого процесса. Так, если для метода секвенирования ДНК химической деградацией было необходимо наличие одноили двуцепочечного фрагмента, несущего на одном (гомогенном) из своих концов единственную метку, то для секвенирования ферментативным методом необходимо наличие немеченной матрицы ДНК и при этом желательно одноцепочечной. Хотя, следует отметить, что матрица ДНК, несущая какуюлибо метку (включая и радиоактивную), в большинстве случаев не окажет заметного влияния на заключительный радиоавтограф из-за большой разницы в размерах самой матрицы и вновь синтезированной в условиях терминации цепи ДНК. Что касается матрицы ДНК, один из концов которой несет метку в виде молекулы биотина, то в этом случае возможна ее сорбция на твердой фазе, например, на магнитных частицах со стрептавидином и проведение так называемого твердофазного секвенирования. При этом выхода биотинилированной метки в заключительный раствор терминирующей смеси, содержащей комплементарную цепь ДНК, меченную уже как-то по-другому и предназначенную для нанесения на секвенирующий гель, даже не произойдет. Ввиду определенных трудностей получения одноцепочечных фрагментов ДНК из двуцепочечных, первые успехи в ферментативном секвенировании были достигнуты с природными одноцепочечными ДНК, такими как бактериофаги фХ17 и fl. Значительные усилия, которые приходилось прикладывать экспериментаторам для получения одноцепочечных матриц ДНК, пригодных для секвенирования ферментативным методом, первое время сдерживали широкое распространение этого метода, поскольку время, затрачиваемое на их получение, являлось основной составляющей всего процесса. Так, в ранних экспериментах по секвенированию ДНК предлагалось клонирование представляющего интерес фрагмента в бактериофаге лямбда с последующим разделением цепей путем весьма длительного ультрацентрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия с поли (U, G), известного достаточно давно. Другим способом получения матриц для секвенирования, также основанном на делении цепей, но уже хроматографией, был путь клонирования фрагментов ДНК в специальном векторе рКН47, сконструированном на основе плазмиды pBR322, и содержащем поли(dA) : поли(dT) дуплексный фрагмент протяженностью около 100 пн. Это позволяло после денатурации плазмидной ДНК осуществлять достаточно эффективное разделение цепей клонированной вставки вместе с векторными последовательностями, одна из которых несла поли (dA) -, а другая – поли (dT)-участки на колонках с олиго(dT)- и олиго(dA)-целлюлозами соответственно. Ферментативное приготовление одноцепочечной ДНК, пригодной для секвенирования, довольно успешно осуществлялось с помощью экзонуклеазы III. В этом случае фрагмент ДНК расщеплялся одной или двумя подходящими рестрикционными эндонуклеазами и в результате его последующей обработки экзонуклеазой III происходило одновременное расщепление обеих цепей ДНК в направлении 3'→5' и образование или двух одноцепочечных фрагментов, не расщепляемых далее экзонуклеазой III, или структур с оставшимся двуцепочечным участком (в случае неполного расщепления). Поскольку экзонуклеаза Ш отщепляет различные нуклеотидмонофосфаты с неодинаковой скоростью, то при полном гидролизе некоторого фрагмента ДНК образуются, как правило, несколько отличающиеся между собой по размеру одноцепочечные субфрагменты, составляющие около половины исходного фрагмента ДНК каждый. В условиях неполного расщепления цепей ДНК экзонуклеазой III сохраняется двуцепочечный участок, где его 3'-концы также будут служить стартовыми точками для ДНК-полимеразы. Однако, ввиду того, что только специфический секвенирующий праймер будет нести концевую метку, лишь продукты построения новой цепи ДНК путем его удлинения будут видны на радиоавтографе. В дальнейшем этот подход получил продолжение и совместное использование экзонуклеазы Ш, имеющей З'-ОН активность, и 5'-Р04-экзонуклеазной активности белка 6 фага Т7 позволило в условиях in vitro получать для секвенирования ДНК ферментативным методом весьма протяженные одноцепочечные матрицы, не прибегая к процедуре субклонирования. Большое значение при таком секвенировании двуцепочечной ДНК приобретает качество выделенного препарата. И одним из главных требований является отсутствие как линейных форм плазмидной ДНК, так и релаксированных, несущих одиночные разрывы цепей ДНК – "ники". В противном случае значительное число новосинтезированных цепей ДНК может оказаться терминированными не специфически, а по причине разрывов цепи в исходной матрице ДНК. Высокую чистоту препаратов плазмидной ДНК, представленной в суперскрученной форме, обеспечивает метод ультрацентрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия, широко использовавшийся в первое время. Однако значительные усилия, затрачиваемые при очистке плазмидной ДНК с помощью ультрацентрифугирования в хлористом цезии, и все большее число плазмид, которые надо было секвенировать, заставляли исследователей разрабатывать новые, более быстрые, простые и дешевые подходы. Тем более что проведенные сравнительные исследования секвенирования двуцепочечных плазмидных ДНК, очищенных в градиенте плотности CsCl и выделенных миниметодом, показали сравнимое качество. Весьма оригинален метод очистки плазмидной ДНК для ее дальнейшего секвенирования с использованием хлористого цезия и бромистого этидия, не требующий ультрацентрифугирования. Этот подход основан на факте образования агрегатов между полисахарами, белками и бромистым этидием в присутствии высокой концентрации CsCl, удаляемых в микроцентрифуге при 10000g. Авторы приводят результаты секвенирования одного и того же образца ДНК, выделенного классическим ультрацентрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия и этим предложенным методом, причем сравнение оказывается даже в пользу последнего, что несколько удивляет. В большинстве случаев выделения плазмидной ДНК для ее последующего секвенирования за основу был взят быстрый щелочной метод. В одной работе было показано, что депротеинизация выделенной щелочным методом плазмидной ДНК кислым фенолом вместо обычно используемой смеси фенолхлороформ, приводит к высокому качеству картины полос секвенированной ДНК. В других работах применялся метод выделения ДНК плазмид кипячением. Сообщается об использовании достаточного длительного метода выделения плазмидной ДНК мягким лизисом с помощью смеси слабых детергентов – бридж-58 и дезоксихолат натрия, показавшего при этом хорошее качество секвенирования. Другая быстрая процедура выделения плазмидной ДНК, пригодной для ферментативного секвенирования, и проводимая всего в одной пробирке, основана на использовании в качестве осаждающего агента цетилтриметиламмониум бромида. Был описан интересный способ получения одноцепочечной матрицы ДНК, легший позднее в основу такого высокопроизводительного метода как твердофазное секвенирование. В цитируемой работе фрагмент ДНК, меченный биотином, сорбировался на твердой фазе в виде авидин-агарозы. После этапов денатурации щелочью и последующей отмывки на оставшейся одной цепи ДНК, связанной через биотин-авидиновый комплекс с агарозой, отжигался секвенирующий праймер и шло построение комплементарной цепи ДНК Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы в условиях терминации. Затем еще один раунд щелочной денатурации приводил к высвобождению новосинтезированных цепей ДНК, пригодных для их разделения секвенирующим гельэлектрофорезом. Авторы в данной статье упоминают о принципиальной возможности повторения циклов отжига праймера и построения цепи по сорбированной матрице, что является, по сути, циклическим секвенированием ДНК.