- •Генная инженерия теория
- •1. Основные открытия современной биологии, послужившие фундаментом для возникновения генетической инженерии
- •2. Предмет и задачи генной инженерии и ее связь с другими биологическими дисциплинами
- •3. Рестрикцирующие эндонуклеазы I, II и III класса
- •4. Особенности ферментов рестрикции II класса
- •5. Другие ферменты нуклеазного действия (s1-нуклеаза, Bal31-нуклеаза, нуклеаза из микрококка, днк-аза)
- •10. Векторы на основе репликонов бактериальных плазмид (pBr322, puc18)
- •11. Векторы на основе бактериофагов (м13, λ)
- •12. Векторы на основе вирусов животных
- •13. Векторы на основе Тi-плазмид
- •14. Основные подходы к получению библиотек днк прокариотических и эукариотических организмов
- •15. Скрининг рекомбинантных днк библиотек
- •16. Получение библиотеки днк с помощью вирусных или плазмидных векторов
- •17. Получение библиотеки днк из отобранных популяций молекул мРнк
- •18. Выявление нужных клонов в генной библиотеке путем гибридизации с радиоактивным днк-зондом
- •19. Выделение перекрывающихся клонов днк («прогулка по хромомсоме») с целью идентификации соседних генов
- •20. Выделение и очистка рекомбинантных клонов
- •21. Секвенирование днк
- •22. Полимеразная цепная реакция (пцр)
- •23. Виды пцр
- •24. Мутагенез клонированной днк
- •25. Методы секвенирования днк
- •26. Использование нерадиоактивных меток при секвенировании. Конструирование делеций для секвенирования.
- •27. Приготовление матриц для секвенирования днк
- •28. Использование для анализа баз данных днк и белковых последовательностей (GenBank, embl, fasta, pir и т.П.)
- •29. Амплификация днк с помощью пцр
- •30. Амплификация рнк с помощью пцр
- •31. Сайт-специфический мутагенез
- •32. Направленный мутагенез с помощью олигонуклеотидов
- •33. Мутагенез с использованием пцр
- •34. Экспрессия белков в e.Coli
- •35. Экспрессия белков с использованием векторов с регулируемыми элементами фага лямбда
- •36. Экспрессия белков с использованием специальных экспрессирующих векторов
- •37. Повышение эффективности систем экспрессии эукариотических белков в клетках e.Coli
- •38. Генно-инженерные системы для получения бав
- •39. Анализ белков
- •40. Генно-инженерная система бактерий рода Bacillus
- •41. Генно-инженерные системы грам-положительных микроорганизмов родов Streptomyces
- •42. Генно-инженерные системы коринеформных бактерий
- •43. Генно-инженерная система дрожжей Saccharomyces
- •44. Системы экспрессии на основе бакуловирусов
- •45. Продукция больших количеств белков в клетках насекомых
- •46. Системы для экспрессии белков в животных клетках
- •47. Векторы экспрессии на основе вирусов животных
- •48. Электрофоретический анализ белков
- •49. Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот
- •50. Иммуноблоттинг и иммунодетекция
- •51. Введение днк в клетки животных, растений, бактерий, дрожжей
- •52. Конструирование линий клеток, суперпродуцирующих бав
- •53. Получение трансгенных растений и животных с полезными свойствами
- •54. Генная тераия болезней человека и животных, являющихся следствиями дефектов генетического аппарата и его функций
36. Экспрессия белков с использованием специальных экспрессирующих векторов
Ответ. Для скрининга обширных (до 5х1010 клонов) библиотек комплементарных ДНК (кДНК), кодирующих редко встречающиеся белки, были разработаны специальные системы слияния. Обьчно кДНК встраивают в гены поверхностных белков (белков филаментов или пилей) нитчатых бактериофагов (например, М13) или бактерий и после транскрипции и трансляции получают химерные белки, входящие в состав поверхностных структур этих микроорганизмов. Здесь их идентифицируют иммунологическими методами. Часто для слияния используют ген поверхностного белка pIII фага М13, который связывается с F-пилями Е. coli и инициирует инфекцию. Для клонирования кДНК и других кодирующих последовательностей была сконструирована плазмида (фагмида), содержащая небольшой фрагмент ДНК M13, который обеспечивал ее упаковку in vitro в фаговые частицы. ген белка pIII под контролем какого-нибудь регулируемого бактериального промотора (например, lac-промотора Е. coli) и сайт клонирования вблизи 5'-конца гена рIII. После репликации рекомбинантного фага М13 в E. coli белок-мишень оказывался сшитым с N-концом фагового белка, и содержащие его бляшки можно было идентифицировать иммунологическими методами. Рекомбинантные фагмиды, выделенные из таких бляшек, могут служить источником соответствующей кДНК. Эта весьма эффективная селективная система позволяет обнаруживать кДНК редких, но очень важных белков. Примером метки, применяемой для очистки белков, является полигистидиновый участок, добавляемый к N- или С-концу белка путѐм включения в кодирующую его последовательность ДНК 6–10 гистидиновых кодонов. После биосинтеза белок, содержащий такую метку, легко очистить путем хроматографии в колонке, содержащей никель-аффинный сорбент, который специфически хелатирует полигистидиновые участки белка. Элюцию белка проводят путѐм промывки буфером, содержащим имидазол. В качестве меток для секреции используют сигнальные пептиды периплазматических или внеклеточных белков (OmpA, PhoA). Для обнаружения экспрессированного белка применяют метки с участками белка с-Myc или зелѐного флуоресцирующего белка (GFP). Библиотеки, содержащие гены поверхностных бактериальных белков, можно использовать и для идентификации клонов, несущих специфические нуклеотидные последовательности. Чтобы включить искомый белок в поверхностные структуры грамотрицательной бактерии, например E. coli, сшивают его гены и гены белков этой структуры. В качестве бактериальных белков используются белок наружной мембраны А (ОгпрА) и пептидом и кансвязанный липопротеин (PAL) E. coli, а также белок F наружной мембраны Pseudomonas aeruginosa (OprF). При этом белок-мишень обычно находится либо на С-, либо на N-конце химерного белка, но иногда короткие полипептиды включаются в середину молекулы бактериального белка. Системы слияния с локализацией белков-мишеней на поверхности бактериальных клеток можно использовать также для суперпродукции некоторых белков и пептидов. Так, в одной из работ в участок, кодирующий основной белок наружной мембраны Pseudomonas aeruginosa (OprF), был встроен ген антигенного детерминанта возбудителя малярии Plasmodiutn falciраrит. Бактериальные клетки, синтезирующие соответствующий химерный белок, давали положительную реакцию с моноклональными антителами к P.falciparum. Следовательно, поверхностные химерные белки можно использовать в качестве вакцин.