37. Повышение эффективности систем экспрессии эукариотических белков в клетках e.Coli

Ответ. Для повышенной экспрессии целевых белков в клетках используют векторные молекулы (векторы экспрессии), включающие в себя экспрессионную кассету – участок ДНК, содержащий регуляторные нуклеотидные последовательности, обеспечивающие высокий уровень экспрессии находящегося под их контролем целевого гена. Чаще всего регуляторные области кассеты обеспечивают индукцию экспрессии гена каким-либо физическим либо химическим фактором, что позволяет избежать негативного влияния сверхэкспрессии целевого белка на физиологию клеток при их культивировании. Экспрессионная кассета может содержать следующие участки: сильный регулируемый промотор, операторную область, участвующую в регуляции транскрипции, сайт связывания рибосом, старт-кодон, полилинкер для введения кодирующей целевой белок последовательности, стоп-кодон, терминатор транскрипции, а также несколько кодонов, обеспечивающих появление дополнительной N- или С-концевой аминокислотной цепочки на синтезируемом белке (так называется метка). Сайт связывания рибосом (RBS) и старт-кодон. В бактериальных клетках инициация трансляции является скорость-лимитирующей стадией в биосинтезе белка. Для инициации трансляции требуется наличие в мРНК старт-кодона и расположенной перед ним 5'-нетранслируемой области, содержащей участки связывания рибосом. Для E. coli наиболее распространенным старт-кодоном является кодон ATG, частота его встречаемости составляет 83%, для остальных старт-кодонов частота использования значительно ниже: 14% для GTG и около 3% для TTG. В прокариотических экспрессионных векторах применяется элемент 5'-нетранслируемой области – последовательность Шайна–Дальгарно. Последовательность Шайна–Дальгарно, или сайт связывания рибосом, представляет собой пурин-богатую последовательность, комплементарную 3'-концу 16S РНК. Сайт связывания рибосом располагается на расстоянии от 5 до 13 оснований (в среднем 7) до инициирующего кодона ATG и имеет консенсусную последовательность AGGAGG. Данная консенсусная последовательность выведена на основании сравнения ряда последовательностей отдельных сайтов связывания рибосом. Комплементарная последовательность CCCUCCU находится на 3'-конце структурной 16S РНК малой субъединицы рибосомы, и образование парного комплекса с последовательностью Шайна–Дальгарно необходимо для инициации биосинтеза белка. Выше по течению от последовательности Шайна–Дальгарно располагается короткий участок, называемый преинициаторным сайтом связывания. В процессе инициации трансляции 30S субъединица рибосомы сначала связывается с вспомогательным сайтом, затем «скользит» вдоль мРНК в направлении участка связывания с 16S рРНК. Последовательность Шайна–Дальгарно влияет на инициацию трансляции и поэтому является привлекательным объектом для генетической инженерии. Даже изменение нескольких оснований может привести к значительному повышению уровня экспрессии рекомбинантного белка. Сайт связывания рибосом может влиять на уровень трансляции целевого гена двумя способами. Во-первых, последовательность сайта Шайна–Дальгарно влияет на эфективность связывания мРНК с рибосомой. Во-вторых данный сайт может влиять на стабильность мРНК, увеличение времени жизни мРНК приводит к повышению трансляции целевого гена. В экспрессионных векторах обычно используют RBS последовательности активно экспрессируемых генов E.coli или бактериофагов. Например, в семействе экспрессионных векторов pRSET и векторов pET-системы применяют сайт связывания рибосом гена 10 бактерифага T7. Термином «промотор» в широком смысле называют сочетание непосредственно промоторного участка (сайта связывания РНК-полимеразы) и оператора (регуляторного элемента, например, LacO). Промотор обеспечивает связывание с РНК-полимеразой и факторами транскрипции и поэтому оказывает значительное влияние на время и место экспрессии целевого гена. Промоторная область обычно состоит из двух гексамерных последовательностей, находящихся в положении 10 и 35 пар нуклеотидов перед последовательностью целевого гена и отделенных друг от друга спейсером в 16– 19 пар оснований. В E. coli чаще всего эти участки соответствуют консенсусным последовательностям TATAAT (ТАТА-бокс) и TTGACA для 10 и 35 участка соответственно. Специфичность РНК-полимеразы E. coli определяется фактором транскрипции, называемым сигма-фактором. Кишечная палочка обладает 7 разными сигма-факторами и 7 соответствующими типами промоторов. Наиболее часто используемая клеткой E. coli промоторная область распознается фактором сигма-70 (названным так по молекулярной массе – 70 кДа). В зависимости от возможности индукции экспрессии генов среди промоторов, применяемых в биотехнологических процессах, можно выделить: конститутивные – запускают транскрипцию нижележащих генов вне зависимости от внешних факторов; индуцируемые промоторы – нижележащие гены экспрессируются только при воздействии факторов окружающей среды или определенных веществ. По происхождению промоторы бывают: природные – последовательности промоторов, встречающихся в живой природе; синтетические промоторы – состоят из консенсусных участков различных природных промоторов (в том числе разных организмов), либо получены путем мутагенеза природных промоторов. В геноме E. coli присутствует около 2 500 природных промоторных последовательностей. Часть из них применяется в плазмидных векторах (Plac, Ptrp, ParaBAD, PrhaBAD и др.), так как они позволяют проводить тонкую регуляцию экспрессии гена. Помимо природных промоторов широко применяются также и синтетические, гибридные промоторы, состоящие из участков различных промоторных последовательностей (Ptac, Ptrc, PT7/lac, PT5/lac и др.). Постоянная трансляция чужеродных белков может быть токсичной для клеток кишечной палочки. Даже в случае, если экспрессирумый белок не является токсичным, экспрессия большого количества белка может привести к его накоплению в виде нерастворимых агрегатов, так называемых телец включения. Поэтому важно обеспечить контролируемую трансляцию белка, что достигается включением в состав плазмиды индуцибельных промоторных участков. Инициация транскрипции может запускаться добавлением индуктора (ИПТГ, арабиноза), изменением температуры, pH, ионной силы. На практике наиболее часто используемыми факторами, регулирующими активность промотора, являются регуляторные белки, реагирующие на изменение температуры среды и источника углерода. Большое распространение получили промоторы элементов контроля метаболизма lac лактозы E.coli. Широкое распространение ввиду их эффективности и специфичности получили фаговые промоторные последовательности (T7, T5, T3, SP6, PL). Промотор бактериофага Т7 является сильным промотором и обеспечивает очень высокий уровень транскрипции целевых генов. Для транскрипции гена под контролем Т7 необходима РНК поли мераза бактериофага T7. Данный фермент очень активен и высокоспецифичен к последовательности промотора бактериофага T7. Транскрипция гена в плазмиде под управлением T7 промотора может быть запущена после синтеза T7 полимеразы ген, который встроенной в геном штамма-продуцента в виде профага (λDE3). Ген полимеразы, в свою очередь, может находиться под управлением индуцируемого промотора, такого как lac. T7 промоторы используются во многих популярных коммерческих экспрессионных системах, таких как pET, pRSET, pCal. Промоторный участок бактериофага Т5 распознается РНК-полимеразой E. coli и поэтому не требует фаговых транскрипционных ферментов. Наиболее распространенной экспрессионной системой, в которой применяется данный промотор, являются плазмиды семейства pQE. В этих плазмидах промотор Т5 контролируется двумя lac-операторами (LacO), при добавлении ИПТГ репрессор освобождает lac-операторы и запускается транскрипция целевого гена. Для экспрессии белковых продуктов в клетках E.coli часто применяют регулируемые промоторы, сконструированные на основе промотора оперона lac, транскрипция с которых индуцируется внесением ИПТГ или лактозы при наличии в векторе гена lacI. lacUV – усиленный мутантный вариант промотора lac. Промоторы tac и trc представляют собой гибридные последовательности промоторов lac- и trp-оперонов. Более тонкая регуляция экспрессии рекомбинантного гена может быть достигнута применением положительно регулируемых промоторов: арабинозного промотора araP BAD и рамнозного промотора rhaPBAD. Уровень индукции при этом зависит от концентрации индуктора – сахаров арабинозы и рамнозы. Эффективность индукции арабинозного промотора ниже, чем у Т7 промотора, что, вероятно, объясняется большими отличиями в последовательности 35 и 10 участков арабинозного промотора от консенсусной последовательности. При экспрессией белков в клетках E.coli может наблюдаться низкий уровень либо отсутствие белка в клеточном лизате. В случае экспрессии гетерологичных белков это может быть связано с наличием в гене редких кодонов, интронных областей, высокой протеазной активностью используемого штамма, токсическим действием синтезируемого продукта на клетки. В случае таких проблем следует модифицировать последовательность гена, оптимизировать параметры культивирования во время экспрессии, использовать специальные штаммы со сниженной активностью протеаз. Кроме того, в клетках могут образовываться тельца включения – нерастворимые агрегаты неправильно свернутого сверхэкспрессированного белка, что происходит в связи с перегрузкой систем фолдинга белков и отсутствием в клетках E.coli эукариотических систем пост-трансляционных модификаций белков. В случае образования телец включения можно обеспечить их очистку, растворение и рефолдинг целевого белка (участки глутатион-S-трансферазы); использовать специальные метки, повышающие растворимость, или стимулирующие выделение белка в периплазму и внеклеточную среду (сигнал секреции белка OmpA); использовать штаммы с повышенной шаперонной активностью.