40. Генно-инженерная система бактерий рода Bacillus

Ответ. Плазмида рВС16 из В. cereus способна реплицироваться и детерминировать устойчивость к тетрациклину в клетках В. subtilis. После гидролиза рВС 16 рестриктазой EcoRl и обработки ДНК-лигазой получена плазмида рВС16-1, реплицирующаяся в клетках В. Subtilis и сохранившая ген tet. Далее рВС16-1 была рекомбинирована in vitro no -EcoRI-участку с критической плазмидой В. subtilis pBS I. Однако, в В. subtilis гибридная плазмида, состоящая из двух репликонов, оказалась нестабильной и диссоциировала на pBS161 и pBS162. Плазмиду pBS161 гидролизовали рестриктазой Hindlll и фрагменты циклизовали с помощью ДНК-лигазы. После трансформации клеток B. Subtilis в устойчивых к тетрациклину клонах выявили новую плазмиду pBS 161-1, которая представляла собой циклизованный Hindlll-A-фрагмент pBS161. Полученная плазмида имеет единичные участки гидролиза рестриктазами EcoRl, Hindlll, Pstl, встройки по которым не повреждают репликатор и ген tet. Это позволяет применять ее в качестве клонирующего вектора. Недостаток pBS161-l – сложность отбора создаваемых на ее основе гибридных плазмид. Одно из самых важных направлений генно-инженерных исследований на В. Subtilis и других бациллах – создание штаммов, секретирующих чужеродные белки из клеток. Бактерии рода Bacillus могут выделять во внешнюю среду различные белки. Хорошо изучена секреция а-амилазы, пенициллиназы и протеаз. Секретируемые белки имеют на N-конце сигнальный пептид, который отщепляется в процессе секреции, давая начало зрелой форме внеклеточного белка. У изученных секретируемых белков Bacillus сигнальные пептиды необычно длинны (29–34 АК) в отличие от встречающихся в грамотрицательных бактериях и клетках животных (15–25 АК). Клонируя гены секретируемых белков и удаляя затем кодирующую последовательность зрелой формы, можно создать молекулярные векторы экспрессии-секреции для грамположительных бактерий рода Bacillus. В первую очередь данный подход был реализован применительно к гену атуЕ. Этот ген кодирует а-амилазу – один из наиболее изученных и имеющих практическое значение секретируемых ферментов многих штаммов бацилл. Бактериальная а-амилаза используется в промышленном расщеплении крахмала до низкомолекулярных легко усваиваемых дрожжами продуктов (амальтозы, а-глюкозы и коротких а-декстринов), которые необходимы для таких микробиологических процессов, как, например, производство этанола. Выявлено не менее шести генов, участвующих в регуляции продукции этого фермента. Кропотливая многоступенчатая селекция позволила создать множество мутантных штаммов Bacillus, наиболее продуктивные из которых превосходят штаммы дикого типа по уровню синтеза а-амилазы в 103 раз. С развитием методов генно-инженерной реконструкции на системе В. Subtilis возникла идея получения нового поколения продуцентов а-амилаз. При этом для промышленности большой интерес представляли термостабильные формы данного фермента, гены которых можно было извлекать из ДНК термофилов и вводить в определенное генетическое окружение такого хорошо изученного мезофила, как В. Subtilis.