38. Генно-инженерные системы для получения бав

Ответ. Cистема клонирования и экспрессии чужеродных генов в грам-отрицательных бактериях имеет определенные недостатки, часть из которых можно преодолеть, используя в качестве клеток – хозяев гибридных молекул ДНК грамположительные бактерии, и прежде всего представителей рода Bacillus. Основным преимуществом бацилл с точки зрения создания молекулярных векторов является их способность секретировать из клеток в культуральную среду большие количества определенных белков. Это связано с тем, что клеточная стенка у грамположительных бактерий организована более просто, чем у грамотрицательных. Исходя из общности механизмов секреции белков через плазматическую мембрану в клетках различных типов, чрезвычайно заманчиво конструировать методами генетической инженерии гибридные гены, в которых чужеродная кодирующая последовательность состыкована с генэквивалентом сигнального пептида какого-либо секретируемого белка Bacillus. Если детерминируемый таким искусственным геном химерный продукт будет способен секретироваться в культуральную среду, то это значительно упростит очистку изучаемого белка. Возможно, в таком случае чужеродный белок в бактерии будет синтезироваться интенсивнее, чем в варианте без секреции, так как он в меньшей степени будет нарушать метаболизм клеток. Многие виды бацилл, в том числе и самый изученный из них вид Bacillus subtilis (сенная палочка), активно используются микробиологической промышленностью для производства ферментов, антибиотиков, аминокислот и др. Поэтому разработаны методы крупномасштабного культивирования этих микроорганизмов и очистки продуктов их биосинтеза. В. subtilis – непатогенная бактерия, поэтому она более перспективна, чем Е. coli для создания штаммов, продуцирующих фармацевтические вещества. У В. subtilis, как и у большинства других бактерий, компетентность возникает лишь на определенном этапе роста культуры. Для того чтобы стимулировать клетки к захвату ДНК, их выращивают на богатой среде, а затем переносят на бедную среду, где отсутствуют аминокислоты, необходимые ауксотрофным мутантам. Максимальная компетентность обычно достигается на поздней стадии логарифмического роста культуры В. subtilis. Такая культура может храниться при температуре –70°С с сохранением компетентности по крайней мере в течение 6 мес. Актиномицеты рода Streptomyces являются почвенными грамположительными бактериями, которые в отличие от большинства прокариотических микроорганизмов в своем жизненном цикле проходят несколько стадий дифференцировки. Типичный жизненный цикл стрептомицета на твердом субстрате начинается с прорастания споры, дающей начало полигеномному субстратному мицелию, на котором затем формируется воздушный мицелий, преобразующийся в конце цикла развития в цепочки спор. В глубинных культурах споруляция обычно не происходит. В этом случае по завершении вегетативного роста культура сохраняет биосинтетическую активность и способна продуцировать большие количества вторичных метаболитов. Наиболее важными с практической точки зрения продуктами вторичного метаболизма стрептомицетов являются антибиотики. Cтремление создать новые типы штаммов-продуцентов на основе бактерий рода Streptomyces стимулировало разработку для них генно-инженерной системы. Следует подчеркнуть, что стрептомицеты синтезируют широкий спектр внеклеточных ферментов. Поэтому по аналогии с бациллами могут быть созданы штаммы стрептомицетов, секретирующих из клеток целевые белки. Важной особенностью стрептомицетов является также то, что они не патогенны ни для человека, ни для животных. Стрептомицеты не обладают физиологической компетентностью для генетической трансформации, но данное затруднение легко преодолевается при использовании протопластов клеток. Необходимо учитывать, что многие штаммы стрептомицетов несут гены системы рестрикции-модификации. Особенно это характерно для промышленных штаммов, отбираемых с учетом их приспособленности к культивированию в больших ферментерах. Одним из параметров такой приспособленности является устойчивость клеток к фаголизису, которая часто может обеспечиваться высоким уровнем рестриктазной активности. Для стрептомицетов характерно явление, позволяющее методически просто обнаруживать штаммы, несущие конъюгативные плазмиды. Оказалось, что при попадании спор или регенерирующих протопластов плазмидосодержащего штамма на свежезасеянный газон бесплазмидных клеток формируются фенотипически выявляемые микроколонии — оспины. Оспины образуются в результате того, что в клетках реципиентного штамма (клетках газона), получивших в результате конъюгации плазмиду, замедляется процесс споруляции и микроколония плазмидосодержащего клона на газоне сплошного роста бесплазмидных клеток оказывается окруженной прозрачной кольцевой зоной. Данную реакцию ингибирования роста называют летальным зигозисом, и ее фенотипическое проявление обозначают Ltz+. Наличие признака Ltz+ позволило идентифицировать плазмиды у большого числа штаммов Streptomyces. В группу коринеформных бактерий объединяют разнообразные грамположительные бактерии, широко распространенные в природе. Многие непатогенные почвенные изоляты (Согупеbacterium glutamicum, Brevibacterium lactofermentum, Arthrobacter sp.) используются в промышленности для производства глутаминовой кислоты, лизина и других аминокислот, нуклеотидов, а также в процессах конверсии стероидов. По стоимости микробиологической продукции производство аминокислот уступает только производству антибиотиков. Несмотря на большое практическое значение коринеформных бактерий, их генетика изучена пока слабо, хотя пути биосинтеза аминокислот и способы их регуляции исследованы основательно. При селекции эффективных продуцентов аминокислот широко применяют аналоги этих соединений. Действуя как ретроингибиторы или корепрессоры, аналоги выключают синтез естественных метаболитов, однако не могут заменить их функционально. Поэтому на минимальной среде с антиметаболитом выживают и образуют колонии лишь те клетки, у которых нарушены механизмы негативной регуляции биосинтеза соответствующей аминокислоты и которые вследствие этого избыточно ее синтезируют. Следует отметить, что устойчивость к аналогу могут вызывать также мутации, которые просто блокируют его поступление в клетку. Поэтому обычно проводят несколько этапов селекции, используя различные аналоги или повышающиеся концентрации одного и того же аналога. В результате такой селекционной работы удается существенно увеличить продуктивность штаммов по целевому соединению. Однако при данном классическом подходе невозможно получить новые каталитические активности. Такую задачу можно успешно решить лишь методами генетической инженерии. Принципиальное значение при разработке генно-инженерной системы любого организма имеют создание молекулярных клонирующих векторов и поиск методов генетической трансформации клеток. На первых порах плазмидную трансформацию коринеформных бактерий осуществляли, используя протопласты клеток. В последующие годы была продемонстрирована возможность применения для этих целей метода электропорации. Пекарские дрожжи S. cerevisiae являются наиболее изученными в биохимическом и генетическом плане эукариотическими организмами. Это обусловлено тем, что для них применимо большинство методов, разработанных для манипуляций с бактериальными культурами. Дрожжи можно выращивать на простых питательных средах, в том числе агаризованных, в обычной бактериологической посуде и с использованием стандартного бактериологического оборудования. Методология работ с культурами клеток животных и растений существенно сложнее, и при этом необходимы специальные дорогостоящие питательные среды и оборудование. Кроме простоты культивирования дрожжи характеризуются высокой скоростью размножения и наличием небольшого числа стадий в цикле развития, смена которых легко контролируется в эксперименте. Будучи типичными эукариотами, дрожжевые клетки представляют собой удобную модель для изучения молекулярных основ наследственности и изменчивости высших организмов. Большое внимание дрожжи привлекли к себе как объекты генно-инженерных экспериментов, направленных на создание высокоэффективных технологий биосинтеза различных белков высших эукариот. У дрожжей-сахаромицетов подробно изучен клеточный цикл развития. Клетки S. cerevisiae делятся почкованием. Вегетативные клетки штаммов, выделяемых из природных образцов или используемых в производстве, как правило, диплоидны. При определенных условиях в них происходит мейоз, и диплоидная клетка превращается в аск с четырьмя гаплоидными аскоспорами, окруженными общей оболочкой. Эти структуры называют тетрадами. Оболочку аска можно разрушить механически или ферментативно и с помощью микроманипулятора при наблюдении в микроскоп разъединить аскоспоры. После прорастания каждая спора дает начало отдельному гаплоидному клону со специфическим генотипом и фенотипом. Данный подход, называемый тетрадным анализом, позволяет методически просто выяснять, локализован ли изучаемый генетический маркер на хромосоме или он входит в состав внехромосомных генетических элементов. Одно из преимуществ S. cerevisiae как экспериментальной системы – простота и надежность ее генетического анализа. Дрожжевые штаммы могут существовать как стабильные гаплоиды, что значительно упрощает, по сравнению с большинством диплоидных эукариотических систем, получение мутантов.