54. Генная тераия болезней человека и животных, являющихся следствиями дефектов генетического аппарата и его функций

Ответ. Генотерапия – новейший подход к профилактике и борьбе со многими наследственными и ненаследственными болезнями. Сейчас в мире насчитывается порядка 400 программ, направленных на лечение с помощью генотеропии. Типы генотерапии: заместительная – в клетку вводится неповрежденный ген. Внесенная копия берет на себя задачи сохранившегося в геноме больного дефектного гена; корректирующая – в результате рекомбинации нормальный ген заменяет дефектный. Пока этот метод на стадии лабораторных испытаний, так как эффективность его еще очень низка. Генная терапия проводится или в культуре клеток (еx vivo), или в организме (іn vivo), что определяется способом введения экзогенных ДНК в геном. В первом случае выделяются и культивируются специфические типы клеток пациента. После в них вводятся чужеродные гены, отбираются трансфецированные клетки, которые вводятся тому же пациенту. Сегодня большинство программ генной терапии основано именно на этом подходе. Во втором случае осуществляется прямое введение в специфические ткани больного клонированных и определенным образом упакованных последовательностей ДНК. Вводимые ДНК обычно интегрируются с молекулами, обеспечивающими их адресную доставку в клетки-мишени. Этот подход на перспективу найдет широкое применение в массовом лечении распространенных заболеваний. Пока он используется в борьбе с муковисцидозом. Этапы. Получение клеток от больного. Использование собственных клеток пациента (аутологичных клеток) исключает вероятность развития иммунного ответа после инфузии или трансплантации. Культивирование клеток в питательной среде. Перенос терапевтическог гена. Отбор и наращивание генетически исправленных клеток. Введение клеток реципиенту. Трансфекция – это искусственное введение в клетки эукариот изолированных молекул ДНК. Условия, обеспечивающие успех генотерапии: эффективная доставка чужеродного гена в клетки-мишени; длительная персистенция гена в клетках-мишенях; экспрессия – полноценная работа введенного гена. При трансфекции используются: чистые («голая» – naked) ДНК, лигированные в плазмиду; комплексированные ДНК – плазмидные ДНК, комплектованные с солями, белками (трансферрином), органическими полимерами (декстраном, полилизином), липосомами или частицами золота; ДНК, входящие в состав вирусных частиц, предварительно лишенные способности к репликации. Чтобы персистенция была длительной, чужеродная ДНК в клеткахреципиентах должна встроиться в геном – в ДНК клетки-хозяина. Экзогенная ДНК элиминируется, если она в ядре находится в свободном состоянии. Экспрессия чужеродной ДНК возможно лишь при наличии соответствующих промоторов. Чужеродные гены доставляются в клетки посредством химических, физических и биологических методов. Эффективность введения чужеродных генов in vitro обеспечивают такие физические способы как электропорация, бомбардировка частицами золота, а также практически все виды биологической доставки. В то же время реальная интеграция в геном клетки-реципиента достигается, если используются ретровирусные или аденоассоциированные вектора, так как они имеют свойства, необходимые для встраивания в эукариотическую ДНК. Лишь вирусные векторы или генетические конструкции с вирусными последовательностями способны к активной трансфекции, а в ряде случаев – и к длительной экспрессии чужеродных генов. Успехи, достигнутые в генной терапии: нормализация работы онкогенов и супрессоров опухолей; обучение иммунной системы распознавать антигены раковых клеток. Этот принцип стал основой для создания противоопухолевых вакцин; получены первые положительные результаты применения нового способа лечения некоторых нейродегенеративных заболеваний (болезни Паркинсона, хорея Гентингтона), в основе которого лежит введение в определенные подкорковые отделы мозга культуры клеток, синтезирующих набор белков, препятствующих дегенерации нервных клеток; разработаны генотерапевтические подходы к лечению ВИЧинфекции. В генной терапии не только совершенствуются существующие, но и разрабатываются новые методы введения чужеродных ДНК в клеткиреципиенты. Например, для борьбы с генными болезнями іn vivo предложены аэрозольные и инъецируемые вакцины. Аэрозольная генотерапия на перспективу будет использоваться в массовом лечении пульмонологических заболеваний: муковисцидоза, эмфиземы, рака легких. В этом случае осуществляется генетическая модификация специфических типов клеток легких. Инъецируемые вакцины позволят работать с разными типами клеток, то есть они станут распространенным и универсальным способом доставки ДНК в любые ткани. Не исключено, что в ближайшее время станет доступной генетическая модификация предшественников дифференцированных клеток – стволовых клеток. В качестве такой перспективы выступает трансформация тотипотентных эмбриональных стволовых клеток, которые при определенных условиях могут стать любыми соматическими клетками. Многими генно-инженерными лабораториями, центрами, фармацевтическими фирмами потрачено немало сил на поиск и создание векторов. В то же время до сих пор нет векторов, обеспечивающих 100-процентную трансфекцию (как ex vivo, так и іn vivo) на фоне высокой пакующей способности, при которой включаются генетические конструкции размером от 1 до 1000 тыс. п.о. Пока не предложен способ регуляции экспрессии. Остается открытый вопрос, касающийся уровня безопасности онкогенных модификаций и других нежелательных побочных эффектов. Коррекция генетических дефектов в зародышевых клетках – вероятная причина засорения генофонда нежелательными искусственными генными конструкциями. Факторы, препятствующие широкому использованию возможностей генотерапии. Недоступность широким массам в силу дороговизны терапевтических мероприятий. Этические проблемы, например, при работе с зародышевыми клетками ущемляется право будущих поколений на наследование немодифицированного генома. Трудоемкость разработки и внедрения генотерапевтических. Амавроз Лебера – редкая наследственная врожденная слепота, которая дает о себе знать еще в младенчестве. Дефектный ген RPE65 введет к гибели в сетчатке светочувствительных клеток без их восстановления. Частота патологии – 1 случай на 81000 новорожденных. При Амаврозе Лебера происходит значительное снижение остроты зрения. Заболевание сопровождается плавающим движением глаз, окуло-пальцевым симптомом, косоглазием, деструкцией стекловидного тела, частичным врожденным помутнением хрусталиков и др. симптомами. Американские и английские исследователи инъецировали вирусный вектор, содержащий исправленный ген в один глаз пациентов с диагнозом амавроз Лебеля. Вектор включал фермент, необходимый для продукции светочувствительного пигмента. Генетическую конструкцию вводили в эпителий пигментного слоя сетчатки. Результат первого исследования – восстановление светочувствительности в «пролеченном» глазу у всех 12 пациентов. Степень восстановления зрения четырех детей позволила им заниматься спортом и не отставать в учебе от одноклассников. Комбинированный иммунодефииицит. Причина заболевания – дефект гена аденозиндезаминазы, который ведет к тяжелым, потенциально смертельным инфекциям, нарушению клеточного иммунитета и дефициту антител и к др. нарушениям. У человека с комбинированным иммунодефииицитом легкой формы задерживаются (могут отсутствовать) физическое развитие, моторика. Тяжелая комбинированная иммунная недостаточность (ТКИН). Это форма комбинированного иммунодефицита. Обнаружены как Х-сцепленная, так и аутосомно-рецессивная ТКИН. В случаях заболевания с нормальным количеством В-лимфоцитов обычно наблюдается Х-сцепленное наследование. Впервые попытка лечения такого больного методами генотерапии была предпринята в США в 1990 г. У больного ребенка извлекли Т-лимфоциты, трансформировали ретровирусным вектором, введя нормальный ген аденозиндезаминазы и вернули клетки в организм. Введение приходилось повторять. Более эффективна аналогичная трансформация СК костного мозга. В январе 2009 г. в Италии посредством генотерапии был вылечен 8-ми летний мальчик. У восьми из десяти участников клинического испытания отпала необходимость в ферментозаместительной терапии. Какие-либо серьезные побочные эффекты от применения генотерапии не обнаружены. Х-сцепленная адренолейко дистрофия (АДЛ) – дегенеративное заболевание белого вещества головного мозга. Поражает мальчиков. Частота встречаемости АДЛ – 1 случай на 17000 новорожденных. Смерть наступает до подросткового возраста. Причина АДЛ – дефект обмена жирных кислот, нарушающий миелинизацию нервных клеток. Больные интеллектуально недоразвиты, отстают от сверстников по поведенческим реакциям, имеют проблемы с памятью. У них нарушены походка, зрение (известны случаи атрофии зрительных нервов). Французскими исследователями был скорректирован ген, который вставлялся в клетки крови 7-летнего мальчика, страдающего АДЛ. Некоторые клетки начинали продуцировать протеин, обеспечивающий обмен жирных кислот. Через 2 года прогрессирующее повреждение мозга, характерное для этой болезни, прекратилось. В качестве вектора использовался инактивированный вирус иммунодефицита человека (HIV). Компания Genetix Pharmaceuticals, специализирующаяся на соматической генной терапии, также сообщила в ноябре 2009 года о создании препарата для лечения АДЛ на основе собственных гемопоэтических стволовых клеток костного мозга, «зараженных» модифицированным вирусом ВИЧ (лентивирусный вектор), содержащим ген, отсутствующий в организме больного АДЛ. Такой препарат ввели двум юным пациентам (после миелоаблации), через 15 месяцев остановилось развитие болезни. Муковисцидоз. Это одно из распространенных среди людей белой расы генетически обусловленных тяжелых заболеваний. Оно поражает легкие. Заболеваемость в Центральной Европе – 1 случай на 2500 новорожденных. Причина муковисцидоза – дефект гена, кодирующего белок-регулятор трансмембранной проводимости. Основное проявление дефектного гена – пневмония. Поражаются все эпителиальные клетки. Неповрежденную копию «гена», включенную в аденовирусный вектор или липосому, вводят в форме аэрозоля в дыхательные пути больного. С целью коррекции нарушения при прогрессирующей мышечной дистрофии Дюшенна (заболевании мальчиков, связанном с дефектами Ххромосомы) нормальный ген, кодирующий белок дистрофии, прямо вкалывали в мышечные волокна посредством или «голой» ДНК, или аденовирусного вектора. Другие исследователи трансплантировали больному миобласты после генетической коррекции. Ранее неподвижный ребенок приобретал способность двигаться. Все эти подходы к борьбе с этим заболеванием максимум гарантируют временный терапевтический эффект, что служит причиной необходимости в многократных процедурах введения гена.