52. Конструирование линий клеток, суперпродуцирующих бав

Ответ. Современная промышленная микробиология строится на использовании высокопродуктивных штаммов микроорганизмов, от которых получают метаболиты (аминокислоты, органические кислоты, гормоны и др.), препараты, востребованные в медицине, пищевой промышленности, сельском хозяйстве и прочих отраслях народного хозяйства. Рассмотрим стратегию получения высокопродуктивных штаммов. Подбор вектора, который способен проникнуть в клетку реципиента. Как правило, такими «поставщиками» гена служат ДНК-фаг или бактериальная плазмида. Разрезание плазмиды рестриктазой для образования «липких концов». Надстройка концов ДНК у вектора, чтобы они были комплементарны концам ДНК вводимого гена (если необходимо). Разрушение ДНК донора рестриктазами для выделения генов. Изменение фрагментов геномной ДНК – удаление из них некодирующих областей и участков соседних генов. Объединение в растворе ДНК гена, который планируется интегрировать в геном бактерии, и ДНК вектора. На этом этапе «слипаются» комплементарные концы и образуются водородные связи. Сшивание цепи гибридной ДНК лигазой. Введение гибридной молекулы в клетку бактерии-реципиента. У прокариот структурный ген представляет собой непрерывный участок молекулы ДНК, а включение и выключение транскрипции обеспечивается ее дополнительными факторами, связывающимися с соответствующими участками ДНК. Бактериальная клетка в среднем содержит 2,5 тыс. различных белков, каждая из форм которых составляет порядка 0,04% от их общей массы. При клонировании и экспрессии в бактериях чужеродного гена на долю кодируемого им индивидуального белка может приходиться до 40%. Если этот показатель в клетках превышает 2%, то они называются суперпродуцентами. В целях создания оптимальных условий для наращивания культуры и синтеза в ней высоких концентраций белков, экспрессию клонируемых генов у продуцентов включают только на поздних стадиях их развития

53. Получение трансгенных растений и животных с полезными свойствами

Ответ. Разработано несколько методов введения Ti-плазмидных последовательностей с нужным геном в растение. Метод «промежуточных векторов» (коинтегративных векторов) – в качестве векторов выступают плазмиды кишечной палочки pBR 322. Этапы. Вырезание рестриктазами Т-ДНК из Ti-плазмиды и встраивание в плазмиду pBR 322 для клонирования в Е. соli. Размножение бактерий, содержащих плазмиду с Т-ДНК, с последующим ее выделением. Встраивание нужного гена в клонированную Т-ДНК при участии рестриктаз. Размножение (клонирование в кишечной палочке) рекомбинантной молекулы, содержащей Т-ДНК со встроенным в нее геном. Введение в клетки агробактерий, несущих полную Ti-плазмиду (достигается за счет конъюгации). Между Т-сегментами нативной Ti-плазмиды и промежуточного вектора происходит гомологичная рекомбинация. В результате этого Т-ДНК со встроенным геном включается в нативную Ti-плазмиду, замещая нормальную ДНК. Получаются клетки А. tumefaciens, несущие Ti-плазмиды со встроенными в Т-сегмент нужными генами. Далее их переносят в клетки растения обычным способом, характерным для агробактерий. Второй метод – создание системы бинарных (двойных) векторов. Заражать и трансформировать можно пограничными областями Т-ДНК и одним участком Ti-плазмиды, ответственным за вирулентность. Эти участки могут не находиться в одной и той же плазмиде. Для трансформации растительных клеток необходимо, чтобы в агробактериях содержалась Ti-плазмида с сегментом vir и другая плазмида с ТДНК. Для осуществления экспрессии чужеродных генов нужен специфический промотор из Т-ДНК, например, промотор нопалинсинтетазы. Способы введения сконструированных Ti-плазмид в клетки растений. Природный (более простой) – инокуляция сконструированных штаммов в поврежденные (пораненные) области растения. Трансформация протопластов путем кокультивирования их с агробактериями. Существуют и другие бактерии (A. rhiwgenes), вызывающие усиленное образование корешков при заражении растений. За этот процесс ответственны, содержащиеся в них Ri-плазмиды (root inducing – индуцирующий корни), – естественные безвредные вектора. Поэтому трансформированные с их помощью растительные клетки сохраняют способность к морфогенезу и к регенерации здоровых растений. В связи с этим Ri-плазмиды рассматриваются как более перспективные векторы. Достижения. В наши дни генетическую инженерию растений называют «метаболической», так как она направлена на получение от растений совершенно новых соединений (особых жирных кислот, полезных белков с высоким содержанием незаменимых аминокислот, модифицированных полисахаридов, съедобных вакцин, антител, интерферонов и других «лекарственные» белков, новых полимеров, не засоряющих окружающую среду). Улучшение аминокислотного состава белков растений. В большинстве случаев запасные белки растений имеют несбалансированный для питания человека и животных аминокислотный состав. Например, проламины злаков бедны лизином, триптофаном и треонином, что негативно сказывается на их питательной и кормовой ценности. Традиционная селекция в плане улучшения аминокислотного состава неэффективна, так как необходимые гены часто сцеплены с нежелательными признаками и наследуются вместе. Например, у мутантов кукурузы и ячменя повышение содержания лизина ведет к уменьшению запасных белков и урожайности. Генно-инженерные методы более перспективны для создания улучшенных сортов, так как позволяют избирательно вводить в геном растения-реципиента гены искомого признака. Улучшение аминокислотного состава растений путем генетической модификации – это поэтапный процесс: клонирование генов запасных белков; изучение механизмов тканеспецифичной и временной экспрессии белков и выявление последовательностей ДНК, определяющих данный механизм; целенаправленное изменение последовательностей генов запасных белков для улучшения аминокислотного состава; создание векторов с измененным геном; введение модифицированных генов в растения. Благодаря инструментам генной инженерии к сегодняшнему дню клонированы гены гордеинов ячменя, гены α- и β-глиадинов и глютенина пшеницы, зеинов кукурузы, легумина бобовых, пататина картофеля и ряд других. Некоторые из этих результатов используются в практике. Так, введение в геном пшеницы модифицированного гена проламина привело к активному синтезу модифицированного белка, а также повлияло на состав и уровень соответствующих запасных белков. Это положительно сказалось на хлебопекарном качестве пшеничной муки. Ведутся работы по изменению состава жиров, полисахаридов. Например, был получен рапс с измененным составом растительного масла, включающего вместе с обычными 16- и 18-членными жирными кислотами до 45% 12-членной жирной кислоты, – лаурата, используемого для производства стиральных порошков, косметических средств. В США ГМ-культура была допущена к продаже в 1995 г. Недавно начаты исследования, целью которых является создание ГМрастений картофеля и других «накопителей» крахмала, в которых это вещество будет находиться в основном в виде амилопектина, то есть разветвленной форме крахмала, или же в основном только в виде амилозы, то есть линейных форм крахмала. Растения – это потенциальные «фабрики» белков животного происхождения. Пример: встраивание в геном растений Arabidopsis thaliana и Brassica napus химерного гена, состоящего из части гена запасного 25-белка арабидопсиса и кодирующей части для нейропептида (энкефалина), приводит к синтезу химерного белка до 200 нг на 1 г семени. Два структурных белковых домена были связаны последовательностью, узнаваемой трипсином, что давало возможность в дальнейшем легко изолировать чистый энкефалин. Этапы трансгеноза животных путем микроинъекции раствора ДНК. Гормональная индукция охоты и полиовуляции по имеющейся для каждого вида животных схеме; Осеменение. Извлечение оплодотворенных яйцеклеток посредством промывания яйцеводов, полученных от забитых на мясокомбинате животных-доноров. Микроинъекция в зиготу. Мероприятия: подготовка рабочего места и оборудования (двух микроманипуляторов для управления удерживающей и инъекционной пипетками и прибора для регулирования инъекционного давления); установка на столике микроскопа инъекционной камеры со средой, покрытой парафиновым маслом; помещение в среду зиготы; фиксация зиготы на удерживающей пипетке таким образом, чтобы хорошо был виден инъецируемый пронуклеус; наполнение кончика инъекционной пипетки (внутренний диаметр не более 1 мкм) раствором ДНК; введение пипетки в пронуклеус (ядро) и инъекция 1-2 пкл раствора ДНК. Показателем удачной работы служит набухший пронуклеус; освобождение эмбриона от удерживающей пипетки с последующим его культивированием до момента пересадки. Пересадка реципиентам: коровам и кобылам – по 7-дневному эмбриону в каждый рог матки в стадиях поздней морулы или ранней бластоцисты; крольчихам и свиноматкам – по 20-30 зигот (в первом случае раздельно по яйцеводам, а во втором – в один яйцевод); овцематкам и коз – по 3-4 эмбриона. Мечение каждого родившегося животного, отбор у них проб крови для доказательства интеграции ДНК при помощи дот-блот-гибридизации по Саузерну. В 1998 г. предложен принципиально новый и при этом простой, эффективный метод переноса трансгена в ооциты – со спермиями. Такой подход успешно использован на крупном рогатом скоте, курах, свиньях. Пересадка трансформированных клеток в энуклеированные яйцеклетки. В данном случае ген вводится в соматические клетки путем трансфекции – искусственной интеграции чужеродной ДНК в геном культивируемых клеток животных и человека путем прямого переноса. В качестве соматических клеток используют фетальные фибробласты (эмбриональные зародышевые клетки, отслаивающиеся от плода и находящиеся в амниотической жидкости в виде суспензии), генетически модифицированные разными методами. Их подсаживают к энуклеированным ооцитам и соединяют с цитоплазмой, как правило, электрослиянием. Реконструированные ооциты, вступившие в стадию эмбрионального развития, трансплантируются реципиентам. Таким образом, осуществляется клонирование животных путем пересадки не обычной, а генетически трансформированной соматической клетки в энуклеированную яйцеклетку. Основные направления применения генетической инженерии в животноводстве: увеличение скорости роста; повышения молочной продуктивности; улучшение качества продукции; создание устойчивых к заболеваниям стад; создание животных-биореакторов БАВ. Преимущества трансгенных животных. Трудно и дорого создавать лишь родоначальников. Полученные от них линии воспроизводятся сами по себе (естественно под контролем человека). Делают возможным получение большого количества белков с низкой стоимостью. Способ получения рекомбинантного белка с молоком – доение, которое удобно, давно отработано и не требует больших финансовых, временных и трудовых затрат. К тому же доение не вредит здоровью животного. Одним из основных этапов в получении трансгенных животных, продуцирующих гетерогенный белок с молоком, является идентификация промотора, который будет направлять экспрессию в секреторный эпителий молочной железы. В настоящее время выделены промоторы аS1-казеина, ßказеина, α-лактольбумина; ß-лактоглобулина и сывороточного кислого протеина (WAP). Использовать молочную железу в качестве «фабрики» чужеродных протеинов выгодно потому, что она обладает высокой синтетической белковой продуктивностью. Общая концентрация эндогенных молочных белков определяется видовой принадлежностью животных и колеблется в пределах 2–10% или 20–100 г на литр молока. Рекомбинантные белки, полученные из молока трансгенных животных: человеческий белок С; альфа-1-антитрипсин; химозин. В 2006 г. запущено производство и реализация сентритромбина, полученного из молока трансгенных коз (фирма «GTC Терапевтик»).