17. Получение библиотеки днк из отобранных популяций молекул мРнк

Ответ. Библиотеки кДНК составляют копии ДНК, комплементарные РНК. Библиотека кДНК отражает спектр генной активности в клетках, из которых она была выделена. Банком кДНК называют коллекцию ДНК-копий мРНК клеток конкретной ткани на определенной стадии развития организма. Типичная клетка млекопитающих содержит от 10 до 30 тысяч разных мРНК со средним размером 1,5–2 тысячи нуклеотидов, треть из которых представлена низким числом копий (менее 10–15 на клетку). Именно эти редкие мРНК определяют, какое число клонов кДНК необходимо отобрать, чтобы банк был представительным. Для вероятности 99% это число близко к 2,00000. Как источник клонирования генов для некоторых приложени комплементарные последовательности ДНК предпочтительнее геномных библиотек, поскольку: кДНК содержит только экзоны гена и, следовательно, прямое представление кодирующей последовательности гена без интронов и промотора; комплекты кДНК, представляющие копии одного гена, могут отличаться, что указывает на наличие альтернативных промоторов, или точек полиаденилирования, или различных точек сплайсинга, так что некоторые экзоны могут или включаться, или исключаться из некоторых копий; использование конкретного источника мРНК в значительной степени увеличивает число копий известного гена, выборочно экспрессированного в этой ткани. Например, несколько килобаз ДНК, содержащих бета-глобиновый ген, представляют всего одну миллионную часть геномной библиотеки человека, однако это главный мРНК транскрипт в эритроидных клетках. Таким образом, библиотеки кДНК, созданные из предшественников эритроцитов, – оптимальный источник выделения кДНК, соответствующей мРНК (3-глобина). Клонирование кДНК происходит с участием фермента обратной транскриптазы – РНК-зависимой ДНК-полимеразы, полученной из ретровирусов, способных синтезировать однонитевой фрагмент кДНК на основе РНК-шаблона. Полученная единичная нить кДНК служит шаблоном для ДНК-полимеразы, преобразующей однонитевую молекулу в двухнитевую спираль. Ее используют в подходящем векторе для создания библиотеки кДНК, представляющей все исходные копии мРНК, обнаруженные в начальном типе клеток или ткани. кДНК, представляющая конкретную мРНК во всей ее полноте, особенно полезна, когда нужно представить полную длину кодирующей последовательности гена. Некоторые сложно устроенные векторы, так называемые векторы экспрессии, содержат транскрипционные и трансляционные сигналы, присоединенные к точке вставки кДНК таким образом, что полная кДНК может быть транскрибирована и оттранслирована бактериями, дрожжами или культивируемыми клетками, производя кодируемый белок. Созданы тысячи библиотек кДНК из различных тканей или из одних и тех же тканей, взятых на различных стадиях развития многих организмов. Они стали бесценным источником кДНК для обширного массива копий мРНК. Получение большой библиотеки увеличивает шансы того, что любая интересующая мРНК, независимо от того, насколько она редка, будет, по крайней мере, один раз представлена в библиотеке. Анализ кДНК применяют для изучения клеток, по какой-либо причине меняющих активность своих генов. Зачастую кДНК служат также зондами. Например, если в геномном банке нужно найти методом гибридизации клон с заданным геном, а специфическая мРНК представлена в малом количестве, то сначала синтезируют кДНК, клонируют ее, метят и используют для скрининга. Выделение и очистка доминирующей мРНК из высокоспециализированных клеток является относительно простой задачей, что позволяет сразу синтезировать индивидуальную кДНК. кДНК для редко встречающихся мРНК можно получить только скринингом банка кДНК. Успех синтеза полноразмерных кДНК зависит от качества выделенной суммарной мРНК. Небольшой размер кДНК позволяет вести ее клонирование в плазмидных векторах, однако для получения банков предпочитают использовать лямбдавекторы, что облегчает хранение рекДНК. Синтезированные двунитевые кДНК обрабатываются ДНК-полимеразами с целью образования у них ровных концов. Затем их инкубируют в присутствии ДНК-лигазы фага Т4 и большого молярного избытка подходящих линкеров, обрабатывают соответствующей рестриктазой и, очистив от линкеров, лигируют по липким концам с вектором. Для предотвращения олигомеризации кДНК в процессе лигирования необходим высокий молярный избыток векторных молекул по отношению к кДНК. При этом повышается вероятность объединения плеч вектора, поэтому их концы до лигирования приходится дефосфорилировать. Для образования липких концов при создании банка кДНК следует предпочесть редкощепящие рестриктазы, так как велика вероятность того, что многие молекулы кДНК будут содержать сайты рестрикции для обычных рестриктаз. Конечно, возможно проведение их предварительной модификации с помощью одно-именных сайт-специфических метилаз. В качестве альтернативы используют адаптеры вместо линкеров. В этом случае отпадает необходимость обрабатывать кДНК рестриктазой. Создан вектор, позволяющий без переклонирования: получать банки полноразмерных кДНК, определять их нуклеотидную последовательность и транслировать каждую кДНК in vitro или in vivo. Создание кДНК начинается с синтеза на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы комплементарной нити ДНК. Затем создают щелочные условия, разрушают цепь РНК на нуклеотиды, после чего с помощью ДНКполимеразы синтезируют комплементарную цепь ДНК. При этом образуется фрагмент ДНК с тупыми концами. Такую ДНК встраивают в плазмиды и вводят в клетки бактерий. При амплификации плазмиды образуется клон комплементарной копии ДНК (кДНК). Преимущества клоновой ДНК перед клонами геномной ДНК в том, что кодирующая белок нуклеотидная последовательность гена ничем не прерывается. Гены эукариот содержат интроны, которые должны удаляться из транскриптной РНК перед превращением ее в матричную, после чего следует сплайсинг (сращивание). Бактериальные клетки не могут осуществлять такую модификацию РНК, образовавшуюся путем транскрипции гена эукариотической клетки. Поэтому если преследуют получение белка путем экспрессии клонированного гена, то лучше использовать банк кДНК, полученной на основе матричной РНК.