39. Анализ белков

Ответ. Биосинтетическое мечение белков. Метод обогащения молекул стабильными изотопами (2Н, 13C, 15N, 18О и другие) является в настоящее время важным направлением в биохимических и структурнофункциональных исследованиях разнообразных природных соединений и, в частности, аминокислот и белков. Эти изотопномеченые биологически активные соединения (БАС), полученные данным методом с различными уровнями изотопного обогащения являются удобными инструментами для разнопрофильных метаболических и биохимических исследований, медицинской диагностики различных заболеваний, химических синтезов разнообразных изотопномеченых соединений на их основе. Метод электрофореза, предложенный еще в начале ХХ века, сейчас широко используют в биологии и медицине для разделения белков в исследовательских и клинических целях. С помощью электрофореза можно разделить на отдельные компоненты белковую смесь, что позволяет установить молекулярную массу белка или его субъединиц, подтвердить чистоту выделенного белка. Электрофорез белков – это способ разделения смеси белков на фракции или индивидуальные белки с помощью электрического тока в проводящей среде в зависимости от их размера и заряда. Заряд различных белков в растворах с одинаковым рН зависит от аминокислотного состава, так как диссоциация белковых цепей приводит к образованию групп, имеющих положительный или отрицательный заряд. Под влиянием сил электрического поля компоненты разгоняемой системы распределяются согласно их заряду, приобретая соответствующую скорость движения, т.е. происходит электрофоретическое разделение. Результатом проведения электрофореза является электрофореграмма – картина, полученная после разделения сложной смеси с помощью электрофореза и специфического проявления. Со времени своего появления в 1979 году (Towbin с соавт., 1979) блоттинг белков стал обычным инструментом исследовательских лабораторий. Его традиционно используют для обнаружения низких концентраций белков в комплексных образцах или для контроля экспрессии и очистки белков. В самой простой процедуре блоттинга белков, известной как дотблот или слот-блот, используется вакуумная фильтрация для переноса белка на микропористую мембрану. Хотя этот метод обеспечивает качественную информацию об общем уровне экспрессии белков и может выполняться параллельно на нескольких образцах, он не дает информации о молекулярной массе белков. Кроме того, специфичность этого метода может быть поставлена под вопрос, поскольку вместе с интактным белком могут быть обнаружены продукты разложения белка или посттрансляционно модифицированные изоформы. Иммуноблоттинг (Вестерн-блоттинг) применяется для обнаружения специфических белков в геле после электрофоретического разделения. Метод основан на аффинном взаимодействии антител с выявляемыми белками, расположенными в определенной полосе в геле среди других белков. Для этого после проведения электрофореза на гель накладывают нитроцеллюлозную мембрану и обеспечивают латеральное перемещение белков из геля на мембрану (процедура блоттинга). Затем мембрану блокируют от неспецифического связывания антител и проводят иммунодетекцию конкретных полос.