23. Виды пцр

Ответ. «Вложенная» ПЦР – применяется для уменьшения числа побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции. «Инвертированная» ПЦР – используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНК рестриктазамис последующим соединением фрагментов (лигирование). В результате известные фрагменты оказываются на обоих концах неизвестного участка, после чего можно проводить ПЦР как обычно. ПЦР с обратной транскрипцией – используется для амплификации, выделения или идентификации известной последовательности из библиотеки РНК. Перед обычной ПЦР проводят на матрице мРНКсинтез одноцепочечной молекулы ДНК с помощью ревертазы и получают одноцепочечную кДНК, которая используется в качестве матрицы для ПЦР. Этим методом часто определяют, где и когда экспрессируютсяданные гены. Ассиметричная ПЦР – проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых методиках секвенированияи гибридизационногоанализа. ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке. Количественная ПЦР – используется для быстрого измерения количества определенной ДНК, кДНК или РНК в пробе. Количественная ПЦР в реальном времени – в этом методе используют флуоресцентно меченые реагенты для точного измерения количества продукта реакции по мере его накопления. ПЦР длинных фрагментов – модификация ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (10 тысяч оснований и больше). Используют две полимеразы, одна из которых – Taq-полимераза с высокой процессивностью (то есть, способная за один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая – ДНК полимераза с 3'–5' эндонуклеазной активностью. Вторая полимераза необходима для того, чтобы корректировать ошибки, внесенные первой. RAPD–PCR со случайной амплификацией полиморфной ДНК – используется тогда, когда нужно различить близкие по генетической последовательности организмы. В этом методе обычно используют один праймер небольшого размера (20–25 п.н.). Этот праймер будет частично комплементарен случайным участкам ДНК исследуемых организмов. Подбирая условия (длину праймера, его состав, температуру и пр.), удается добиться удовлетворительного отличия картины ПЦР для двух организмов.

24. Мутагенез клонированной днк

Ответ. Спектр мутаций широк, и все их виды (точечные, делеции, инсерции, инверсии) можно осуществлять направленно методами in vitro, получая заданное изменение в определенном гене и даже нуклеотиде. Различают два типа точечных мутаций – сайт-специфический и сегментспецифический. Первый сводится к введению определенной мутации в заданный сайт ДНК. При осуществлении мутагенеза второго типа мутации вводят в участок ДНК ограниченной длины, а распределяются они случайным способом. Внесение специфических изменений в кодирующие последовательности ДНК, приводящих к определенным изменениям в аминокислотных последовательностях, называется направленным мутагенезом. Идентификация аминокислот, замена которых даст желаемый результат, облегчается, если детально известна пространственная структура белка (ее устанавливают с помощью рентгеноструктурного анализа или других аналитических методов). Однако для большинства белков такие данные отсутствуют, поэтому направленный мутагенез – это в значительной мере эмпирическая процедура, основанная на методе проб и ошибок. Каждый белок, кодируемый мутантным геном, нужно протестировать и убедиться в том, что мутация дала желаемый эффект. Для направленного мутагенеза клонированных генов используют разные экспериментальные подходы. В одних случаях вносят изменения в специфические сайты клонированного гена, в других случайным образом изменяют короткий фрагмент клонированного гена и среди образующихся мутантных белков выбирают один, обладающий необходимой активностью. Направленный мутагенез – это внесение специфических изменений в кодирующие последовательности ДНК, приводящих к определенным изменениям в аминокислотных последовательностях. Методики направленного мутагенеза служат для получения белков с заранее заданными свойствами. Это сложная задача, поскольку она требует знания нативной структуры (третичной, четвертичной) белка. Метод направленного мутагенеза клонированных генов имеет существенные преимущества перед методиками химического мутагенеза из-за высокой специфичности. Известно, что свойства любого белка зависят от его конформации, которая, в свою очередь, определяется аминокислотной последовательностью. Некоторые аминокислоты в полипептидной цепи играют ключевую роль в определении специфичности, термостабильности и других свойств белка. Замена единственного нуклеотида в гене, кодирующем белок, может привести к включению в него аминокислоты, что может изменить свойства кодируемого белка. Сайт-направленный мутагенез позволяет одновременно заменять не только единичный нуклеотид или их группу, но и образовывать делецию или наоборот вставку из нескольких нуклеотидов, причем их протяженность может быть довольно большой и зависящей, главным образом, от общей длины синтезированного олигонуклеотида. Олигонуклеотид-направленный (сайт-специфический) мутагенез – это один из наиболее простых методов внесения точковых мутаций в клонированный ген. Для его осуществления необходимо знать: точную нуклеотидную последовательность той области ДНК, которая соответствует мРНК-кодону, подлежащему изменению; характер аминокислотных замен. Обычно встраивают ген-мишень в двухцепочечную форму вектора на основе бактериофага М13. Сначала выделяют одноцепочечную форму вектора (плюс-цепь М13) и смешивают ее с синтетическим олигонуклеотидом, в точности комплиментарным – за исключением одного нуклеотида – нужному сегменту клонированного гена. Этот отличающийся (т. е. неспаривающийся) нуклеотид соответствует тому нуклеотиду кодона мРНК, который необходимо изменить. Олигонуклеотид будет гибридизоваться с комплементарным участком клонированного гена в том случае, если: он добавлен в количестве, во много раз превышающем количество ДНК М13; неспаривающийся нуклеотид находится примерно посередине олигонуклеотида; отжиг проводят при низкой температуре и высокой ионной силе. 3'-конеп спарившегося олигонуклеотида служит затравкой для инициации синтеза ДНК, а интактная цепь ДНК М13 – матрицей. Репликация осуществляется с помощью фрагмента Кленова ДНКполимеразы I Escherichia coli при наличии в среде четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, а присоединение последнего нуклеотида синтезированной цепи к 5'-концу затравки обеспечивает ДНК-лигаза фага Т4. Однако, in vitro синтез ДНК редко идет до конца, и частично двухцепочечные молекулы приходится отделять от нормальных центрифугированием в градиенте сахарозы. Полностью двухцепочечными молекулами ДНК фага М13, содержащими, однако, некомплементарные нуклеотиды, трансформируют клетки Е. coli. В последних образуются фаговые частицы, что, в конечном счете, приводит к лизису клеток и образованию бляшек. Поскольку репликация идет по полуконсервативному механизму, половина популяции образующихся фаговых частиц должна содержать ДНК дикого типа, а половина – мутантную ДНК со специфической нуклеотидной заменой. Частицы, содержащие только мутантный ген, идентифицируют при помощи ДНК-гибридизации в жестких условиях, используя в качестве зонда исходный олигонуклеотид. Мутантный ген вырезают и встраивают в какой-либо экспрессирующий Е. соli-вектор. Мутантный белок синтезируют в Е. coli и очищают. Основной недостаток олигонуклеотид-направленного мутагенеза с использованием фага М13 – большое число процедур. Чтобы выделить мутантную форму нужного гена, приходится затратить много времени. В качестве альтернативы системе с использованием фага М13 было разработано множество других подходов, основанных на применении плазмидных ДНК. Это позволяет обойтись без переноса интересующего исследователя гена из плазмиды в фаговую ДНК, а после завершения мутагенеза – обратно в плазмиду. Один из этих подходов включает встраивание ДНК в плазмидный вектор, который несет функциональный ген устойчивости к тетрациклину и неактивный ген устойчивости к ампициллину; в середине последнего заменен один нуклеотид. Клетки Е. coli трансформируют вектором, несущим ДНК-мишень, и двухцепочечную плазмидную ДНК денатурируют щелочью с тем, чтобы получить одноцепочечные кольцевые молекулы. Денатурированную ДНК отжигают с тремя разными олигонуклеотидами. Один из них предназначен для внесения изменений в клонированную ДНК-мишень, второй – для устранения мутации в гене устойчивости к ампициллину, третий – для замены одного нуклеотида в гене устойчивости к тетрациклину с тем, чтобы инактивировать этот ген. В реакционную смесь добавляют четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата и ДНК-полимеразу Т4, функционирующую аналогично фрагменту Кленова ДНК-полимеразы I Е. coli. Гибридизовавшиеся олигонуклеотиды служат затравками для синтеза ДНК, а интактная кольцевая молекула НК – матрицей. Одноцепочечные разрывы в новосинтезированной цепи зашиваются с помощью ДНК-лигазы Т4. По окончании синтеза и лигирования продуктами реакции трансформируют клетки Е. coli. Трансформантов отбирают по признаку устойчивости к ампициллину и чувствительности к тетрациклину. Более простой и быстрый метод получения больших количеств мутантных генов, альтернативный системе с использованием фага М13 – сайт-специфический мутагенез в сочетании с полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Один из вариантов этого подхода состоит в следующем. Ген-мишень встраивают в плазмидный вектор и помещают препарат в две пробирки. В каждую из них добавляют по два специфических праймера для ПЦР: 1 и 2 в одну пробирку, 3 и 4 – в другую. Праймеры 2 и 3 полностью комплементарны одному из участков клонированного гена или прилегающей к нему последовательности, а 1 и 3 комплементарны другому участку, но содержат один некомплементарный нуклеотид и гибридизуются с разными цепями, так что в результате происходит замена обоих нуклеотидов данной пары. Положение сайтов гибридизации праймеров 1 и 2 в одной пробирке и 3 и 4 – в другой таково, что ПЦР-продукты в разных пробирках имеют разные концы. По окончании ПЦР содержимое пробирок объединяют и проводят денатурацию, а затем ренатурацию. Поскольку концы амплифицированных молекул ДНК из двух пробирок неодинаковы, одноцепочечные ДНК из разных пробирок ассоциируют с образованием кольцевых молекул с двумя одноцепочечными разрывами. Эти разрывы репарируются in vivo после трансформации Е. coli. При ренатурации одиночных цепей из одной пробирки образуются линейные молекулы. В клетках Е. coli стабильно поддерживаются в виде плазмид и наследуются только кольцевые, а не линейные молекулы, при этом все они несут сайт-специфическую мутацию. Таким образом, с помощью описанного метода можно вносить точковые мутации в клонированный ген, при этом отпадает необходимость во встраивании гена в ДНК фага М13, использовании мутантных штаммов Е. coli типа dut ung и в переносе мутантного гена из М13-вектора в экспрессирующий вектор. Случайный мутагенез с использованием «вырожденных» олигонуклеотидных праймеров. Такие «вырожденные» олигонуклеотиды обычно получают, добавляя в автоматический синтезатор ДНК на определенном этапе, когда к цепи должен присоединяться специфический нуклеотид, небольшое количество (до нескольких процентов) трех других нуклеотидов. В результате получается гетерогенный по одному сайту набор олигонуклеотидных праймеров, с помощью которых можно получить соответствующий набор мутантных геновмишеней с нуклеотидными заменами в специфическом сайте. Этот подход имеет два преимущества: не нужно в точности знать, какую роль играет тот или иной аминокислотный остаток в функционировании белка; поскольку в данном сайте происходят разные аминокислотные замены, могут случайно синтезироваться белки с разнообразными интересными и полезными свойствами. Конечно, если ни один из образующихся белков не обладает нужными свойствами, приходится все начинать сначала, синтезировав новый набор «вырожденных» праймеров, комплементарных другой области гена. Случайный мутагенез с использованием аналогов нуклеотидов. Ген-мишень встраивают в плазмиду поблизости от двух тесно расположенных сайтов рестрикции. Эти сайты подбирают так, чтобы после расщепления двумя рестриктазами образовывались укороченные 3'- и 5'-концы, а именно, чтобы 3'- конец сайта расщепления, расположенного рядом с клонированным геном, был укорочен, а 3'-конец с другой стороны плазмиды выступал. Экзонуклеаза III (ExoIII) Е. coli расщепляет молекулу ДНК только с укороченных 3 '-концов, но не с выступающих 3'- или любых 5'-концов. Ее добавляют в реакционную смесь после инкубированния ДНК с двумя рестриктазами, и она отщепляет от укороченного 3'-конца цепи по одному нуклеотиду. Через определенное время реакцию останавливают и заполняют пробел с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I, используя смесь обычных четырех дезоксирибонуклеотидов с добавлением аналога одного из них. В результате получают плазмиды, содержащие ген-мишень, в одном или нескольких сайтах которого находится аналог соответствующего нуклеотида. Ими трансформируют клетки Е.coli. Плазмиды реплицируются, и в клонированный ген включается нуклеотид, отличный от такового в исходном гене.