41. Генно-инженерные системы грам-положительных микроорганизмов родов Streptomyces

Ответ. Первой изученной плазмидой стрептомицетов стала плазмида SCP2 штамма S. Coelicolor A3. Это половая низкокопийная плазмида размером 30 тпн. Спонтанно был выделен вариант данной плазмиды SCP2*, обеспечивающий значительно большую эффективность хромосомной рекомбинации и более интенсивное проявление клетками фенотипа Ltz+. С помощью рестрикционного анализа не удалось обнаружить различий в структуре ДНК SCP2 и SCP2*, кроме того, эти плазмиды имеют одинаковую копийность в клетках (1–5 копий на бактериальную хромосому). Физическое и генетическое картирование SCP2* позволило сделать вывод о том, что гены, контролирующие репликацию плазмиды, перенос, хромосомную рекомбинацию и летальный зигозис, локализованы в левой половине карты, так как производные SCP2*, содержащие только наибольший Pstl- или BamHI-фрагмент, проявляют все эти свойства. На основе SCP2* получен ряд векторных плазмид, содержащих разные гены устойчивости к антибиотикам, в том числе к тиострептону – tsr, неомицдну – aph, а также ген mel, направляющий синтез тирозиназы – фермента, превращающего тирозин в меланиновый пигмент. Последняя детерминанта обусловливает черную окраску колоний Streptomyces на среде, содержащей триптон и ионы меди. При инактивации гена mel за счет встройки чужеродных последовательностей колонии трансформантов оказываются бесцветными, что обеспечивает возможность прямого фенотипического отбора клонов, несущих гибридные плазмиды. Экспериментально показано, что векторные производные SCP2* способны трансформировать большое число разных штаммов Streptomyces. Наряду с низкокопийными векторными плазмидами при решении ряда задач необходимо иметь высококопийные клонирующие векторы. Наибольшее число векторов такого типа создано на основе плазмиды pIJl01 – конъюгативной половой плазмиды небольшого размера (8,9 тпн), имеющей широкий круг хозяев среди представителей рода Streptomyces и детерминирующей фенотип Ltz+. У S. Lividans число копий этой плазмиды варьирует в зависимости от штамма от 40 до 300 на бактериальную хромосом. На основе pIJlOl и ее делеционных производных in vitro сконструированы векторы, маркированные рядом детерминант лекарственной устойчивости. В качестве примера рассмотрим плазмиды рIJ350 и pIJ702. рIJ350 обеспечивает устойчивость к тиострептону – антибиотику, к которому чувствительно большинство стрептомицетов. Она высококопийна, имеет широкий круг хозяев среди стрептомицетов и неконъюгативна. Для клонирования фрагментов ДНК может использоваться лишь сайт Pstl. Более удобный вектор (pIJ702) получен в лаборатории Д. Хопвуда (1983 г.) в результате встройки в рIJ350 фрагмента ДНК, содержащего ген mel S. antibioticus. Данная плазмида содержит уже два маркера, причем ген mel легко выявляется фенотипически. Более того, в составе гена теl имеются единичные участки узнавания рестриктаз Bg/II, Sstl и Sphl. Для молекулярного клонирования в стрептомицетах также были разработаны векторы на основе умеренного актинофага фС31, обладающего широким кругом хозяев. Данный фаг по своей организации напоминает фаг Я. Геном фС31 имеет размер 41 тпн и представляет собой двухцепочечную линейную молекулу ДНК с липкими концами (cos). Фаг может лизогенизировать клетки стрептомицетов, интегрируя свой геном по участку att в бактериальную хромосому. В ДНК фС31 1 имеется непрерывная область размером 8 тпн, несущественная для литического развития фага. Построены рестрикционные карты ДНК фС31 и получены различные векторные производные. Особый интерес векторная система фага фСЗ1 представляет для метода мутационного клонирования. Этот метод разработали К. Чейтер и К. Брутон в 1983 г., использовав в качестве вектора фаг фСЗ1, у которого в геноме делетирован участок att. Такой фаг способен интегрировать свою ДНК в бактериальную хромосому только за счет клеточной системы общей рекомбинации по областям гомологии. На основе векторного фага может быть создан банк генов любого штамма Streptomyces. Гибридными фагами инфицируют клетки и селектируют лизогенные клоны, имеющие нарушения определенного хромосомного гена. Мутация происходит в том случае, когда гибридный фаговый геном интегрируется в целевой ген за счет клонированного в его составе фрагмента хромосомной ДНК. Фаговое потомство мутантных штаммов, образуемое при вырезании профага по фланкирующим гомологичным повторам, содержит в составе генома клонируемые фрагменты. С помощью данного методического приема удается достаточно просто выделять различные гены бактерии-хозяина.