42. Генно-инженерные системы коринеформных бактерий

Ответ. Принципиальное значение при разработке генно-инженерной системы любого организма имеют создание молекулярных клонирующих векторов и поиск методов генетической трансформации клеток. На первых порах плазмидную трансформацию коринеформных бактерий осуществляли, используя протопласты клеток. В последующие годы была продемонстрирована возможность применения для этих целей метода электропорации. Многочисленные попытки вводить разные плазмиды грамположительных и грамотрицательных бактерий не позволили выявить чужеродный репликон, который был бы способен функционировать в коринеформных бактериях, что указывает на узкую специфичность их репликационного ферментного комплекса. Создаваемые клонирующие векторы коринебактерий, как правило, являются челночными плазмидами типа Е. coli – С. glutamicum, В. subtilis – С. glutamicum, E. coli – В. lactofermentum и др. Один из первых подобных векторов сконструировали М. Ёшихама с соавторами (1985 г.) на основе клонирующего вектора В. Subtilis pBDIO и небольшой криптической плазмиды С. Glutamicum pSRl. Аналогично получены идругие векторные плазмиды. Изучение экспрессии генов антибиотикоустойчивости челночных плазмид в первых же работах показало, что в клетках С. Glutamicum эффективно экспрессируются гены грамотрицательной бактерии Е. coli. Следовательно, коринебактерии по организации генов существенно отличаются от бактерий рода Bacillus, так как в последних большинство генов Е. coli не экспрессируются. Челночные плазмиды типа Е. coli – С. Glutamicum оказались очень удобными для извлечения индивидуальных генов С. glutamicum. С этой целью создают клонотеку гибридных плазмид, несущих фрагменты хромосомной ДНК коринебактерий, и данные плазмиды используют для комплементации ауксотрофных мутаций в Е. coli. Селектированные таким образом гибридные плазмиды затем можно вводить в бактерию-донор и изучать экспрессию клонированного гена в гомологичном окружении. Повышенная доза гена обычно приводит к суперпродукции соответствующего фермента. Другой бактерией, используемой для промышленного производства аминокислот, является Brevibacterium lactofermentum, продуцирующая глутаминовую кислоту. Для нее, как и для С. glutamicum, были созданы различные челночные плазмиды, и в их составе клонированы гены ферментов, участвующих в биосинтезе аминокислот. За счет эффекта дозы клонированных генов удалось повысить продуктивность некоторых промышленных штаммов.

43. Генно-инженерная система дрожжей Saccharomyces

Ответ. Для успешной экспрессии чужеродных генов в дрожжах их сигнальные последовательности, ответственные за транскрипцию и трансляцию, необходимо заменять аналогичными участками дрожжевого происхождения. В узнавании промоторов РНК-полимеразой важную роль играют транскрипционные факторы. Сайты для них отсутствуют в бактериальных промоторах, поэтому они не функциональны в дрожжах. Но дрожжевые промоторы функциональны в E. coli. На базе вектора YEp сконструировали вектор pBR45, содержащий маркеры LEU2 и URA3. В ген URA3 внедрили ген lacZ без семи начальных кодонов. Гибридный белок проявлял βгалактозидазную активность при синтезе белка в обоих типах клеток. Первым индивидуальном животным белком, синтезированном в дрожжах, был человеческий лейкоцитарный интерферон INF-a1. Этот ген был подготовлен для клонирования в виде рестриктов EcoRI. Этот ген был клонирован и экспрессирован в плазмиде pFRP. После синтеза белка-предшественника его сигнальная последовательность удаляется при проникновении белка через мембрану ЭПР. Зрелый белок транспортируется в комплекс Гольджи и попадает в мембранные везикулы, которые движутся к плазмолемме и доставляют в периплазматическое пространство белки, которое ―застревают здесь или в клеточной стенке, а далее выходят в культуральную среду. Количество секреции белка зависит от фазы роста и мксимально (30%) в стационарной фазе. Для секреции дрожжевыми векторами чужеродных белков, не имеющих собственной сигнальной последовательности, конструируют специальные векторы, которые кодируют такие последовательности. Так, был использован вектор YEpsec1, который содержит синтетический олигонуклеотид SS, кордирующий сигнальную последовательность из 18 аминокислот секретируемого токсина дрожжей Kluyveromyces lactis. При росте в галактозной среде клетки, содержащие рекомбинантную плазмиду, секретировали в культуральную среду до 1 мг/л интерлейкина-1β без примеси других белков.