45. Продукция больших количеств белков в клетках насекомых

Ответ. Bsu36I-систему линеаризации модифицировали так, чтобы получить сверхвысокую частоту рекомбинантных бакуловирусов. Для этого в геном AcMNPV внесли два Bsu36I-сайта, по одному с каждой стороны гена полиэдрина. Один сайт находился в гене 603 (открытая рамка считывания 603 [ORF603]), а второй — в одном из генов (ORF 1629), необходимых для репликации вирусной ДНК. При трансфекции клеток насекомого с помощью ДНК модифицированного бакуловируса, инкубированного с Bsu36І, репликация вируса не происходила, поскольку отсутствовал фрагмент необходимого для этого гена (ORF1629). Далее был создан транспортный вектор, содержащий ген-мишень и, если это нужно, селективный маркерный ген между интактной копией гена 603 и необходимым для репликации геном. Таким вектором трансфицировали клетки насекомого, которые были предварительно трансфицированы линеаризованной ДНК AcMNPV с делецией участка между Дж36І-сайтами. В результате двойного кроссинговера восстанавливалась функциональная форма ORF1629 и происходило включение клонированного гена в геном AcMNPV. С помощью этой системы доля зон лизиса, содержащих рекомбинантные бакуловирусы, была увеличена до 99%.

46. Системы для экспрессии белков в животных клетках

Ответ. Экспрессию белков в клетках млекопитающих можно осуществлять с использованием бирепликонных ядерных плазмид, аденовирусных и поксвирусных векторов. Для экспрессии применяют конститутивные (промотор цитомегаловируса CMV, вируса SV40, промотор гена фактора элонгации EF-1α) и индуцибельные (промотор TRE3G индуцируется доксициклином) промоторы. Для обеспечения повышенной экспрессии целевых генов успешно используются векторные молекулы на основе аденовирусов. Векторы отличаются высокой клонирующей емкостью (до 38 т.п.н. при использовании ― выпотрошенных векторов), высоким уровнем экспрессии встроенного гена (до 10% от всего клеточного белка), однако реплицируются в ядре и не интегрируются в геном клетки, поэтому экспрессия носит временный характер. Примерами других систем доставки генов на основе вирусов животных являются векторы на основе аденоассоциированного вируса, вируса осповакцины, вируса простого герпеса, а также бакуловирусные векторные системы для клеток насекомых. Ретровирусы относятся к группе вирусов, РНК-геном которых в инфицированных клетках конвертируется в ДНК. Весьма удобным для исследователя является то обстоятельство, что ретровирусные векторы можно размножать, достигая их высокой концентрации в небольшом объеме – более 10⁹ вирусных частиц/см3. В опытах по инфицированию ретровирусами мозга, печени, мышц, глаз или клеток панкреатических островков грызунов показана устойчивая экспрессия трансгенов в течение более 6 мес. Критическим ограничением использования гаммаретровирусных векторов в генотерапевтических процедурах является их неспособность инфицировать неделящиеся клетки, т.е. ткани мышц, мозга, легких и печени. Вирусный преинтеграционный комплекс этих векторов, ответственный за интеграцию вирусной кДНК в геном клетки, имеет слишком большие размеры, чтобы проникать через поры в оболочке клеточного ядра. Такая возможность ему предоставляется только при дезагрегации оболочки клеточного ядра во время митоза. В качестве других недостатков специалисты отмечают генетическую нестабильность гамма-ретровирусных векторов, проявляющуюся делециями или точковыми мутациями. Лентивирусы инфицируют как делящиеся, так и не делящиеся клетки. Наиболее изученным лентивирусом является ВИЧ. Он рассматривается как потенциальный вектор для переноса генов в условиях in vivo. Подобно простым ретровирусам, геном ВИЧ включает гены структурных белков gag, pol и env, и гены шести регуляторных белков, названных tat, rev, vpr, vpu, nef и vif. Гены отдельных белков могут быть убраны из генома вируса без снижения его способности к размножению и инфицированию клеток. Образующиеся в таких системах вирусные частицы являются своего рода инфекционным ретровирусом одноразового действия. При заражении ими клеток-мишеней, не содержащих экспрессирующийся ретровирусный провирус, способный выполнять транс-функции, осуществляется тот же порядок событий, что и при заражении обычным вирусом вплоть до образования интегрировавшегося провируса. Однако, так как вектор не содержит структурных вирусных генов gag, pol и env, образования вирусных частиц не происходит. Аденовирусы – ДНК-вирусы, способные инфицировать оба типа клеток (делящиеся и неделящиеся), включая клетки печени, легких и эпителия. Они реплицируются в ядре инфицированной клетки как эписомные (экстрахромосомные) элементы. По связыванию со специфическими сыворотками аденовирусы разделены на 51 серотип. На основе их способности агглютинировать эритроциты у людей, кроликов и мышей; и по онкогенности для грызунов их подразделяют еще на 6 подтипов или субгрупп. Аденовирусы разных субгрупп поражают различные органы и ткани человека. Исследования по созданию на основе аденовирусов векторов, предназначенных для использования в целях генотерапии, активизировались с начала 1990-х гг. Этому способствовали следующие обстоятельства: ДНК-вирусы рассматривались исследователями как более простые объекты для генно-инженерных манипуляций, чем вирусы с РНК-геномом; ДНК-вирусы реплицируются в неделящихся клетках, например, клетках мышц. Конструирование векторов на основе аденовирусов во многом повторяло путь, пройденный создателями лентивирусных векторов. Дефектные по репликации аденовирусы получали посредством замены гена Е1, который необходим для репликации, на ген, представляющий интерес для исследователя и энхансер-промоторный элемент. Такие рекомбинантные векторы способны эффективно размножаться в пакующих клетках, экспрессирующих продукт гена Е1, давая более 10¹¹–10¹² аденовирусных частиц/см3. Клонирующие векторы на основе вируса герпеса простого имеют простую конструкцию и разработаны хуже, чем векторы на основе аденовирусов. Вирус включает более чем 80 генов, один из которых (IE3) может быть замещен с целью создания вектора. Делетированы могут быть и некоторые другие гены, что позволяет использовать вектор для клонирования нескольких трансгенов. Выход вирусных частиц составляет приблизительно (108–109) см3. Развитие таких векторов затормозили такие препятствия как: непродолжительная экспрессия клонированных генов (от нескольких суток до недель); их способность вызывать цитопатические эффекты и ответы со стороны иммунной системы. Ортопоксвирусы – крупные вирусы, содержащие двунитевую ДНК. Отдельные виды могут иметь либо очень широкий, либо очень ограниченный круг хозяев. Емкость поксвирусного вектора позволяет включить 25 т.п.н. чужеродной ДНК без делеций генома самого вируса.