33. Мутагенез с использованием пцр

Ответ. . Более простой и быстрый метод получения больших количеств мутантных генов, альтернативный системе с использованием фага М13 – сайт-специфический мутагенез в сочетании с полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Один из вариантов этого подхода состоит в следующем. Ген-мишень встраивают в плазмидный вектор и помещают препарат в две пробирки. В каждую из них добавляют по два специфических праймера для ПЦР: 1 и 2 в одну пробирку, 3 и 4 – в другую. Праймеры 2 и 3 полностью комплементарны одному из участков клонированного гена или прилегающей к нему последовательности, а 1 и 4 комплементарны другому участку, но содержат один некомплементарный нуклеотид и гибридизуются с разными цепями, так что в результате происходит замена обоих нуклеотидов данной пары. Положение сайтов гибридизации праймеров 1 и 2 в одной пробирке и 3 и 4 – в другой таково, что ПЦР-продукты в разных пробирках имеют разные концы. По окончании ПЦР содержимое пробирок объединяют и проводят денатурацию, а затем ренатурацию. Поскольку концы амплифицированных молекул ДНК из двух пробирок неодинаковы, одноцепочечные ДНК из разных пробирок ассоциируют с образованием кольцевых молекул с двумя одноцепочечными разрывами. Эти разрывы репарируются in vivo после трансформации Е. coli. При ренатурации одиночных цепей из одной пробирки образуются линейные молекулы. В клетках Е. coli стабильно поддерживаются в виде плазмид и наследуются только кольцевые, а не линейные молекулы, при этом все они несут сайт-специфическую мутацию. Таким образом, с помощью описанного метода можно вносить точковые мутации в клонированный ген, при этом отпадает необходимость во встраивании гена в ДНК фага М13, использовании мутантных штаммов Е. coli типа dut ung и в переносе мутантного гена из М13-вектора в экспрессирующий вектор.

34. Экспрессия белков в e.Coli

Ответ. Получение необходимых белковых продуктов из тканей животных часто осложнено их малой концентрацией в природных источниках, необходимостью многоступенчатой и сложной очистки, риском контаминации конечного продукта опасными для человеческого здоровья инфекционными агентами и токсинами. Например, для получения 100 г человеческого инсулина требуется переработка поджелудочных желез, полученных от более 5 000 коров. В связи с этим долгое время ввиду высокой стоимости и недостаточного уровня производства было невозможно обеспечить всех нуждающихся инсулином и другими лекарствами на основе белков животного происхождения. Разработка технологии рекомбинантных ДНК и методов переноса генов из одного организма в другой совершила настоящую революцию в биологии. Рекомбинантные технологии позволяют не только получить продукт с высоким выходом, но и конструировать биомолекулы с заранее заданными параметрами. С 1970-х годов, когда были получены первые рекомбинантные ДНК-полимераза I, инсулин и соматотропин, появилось множество подходов для получения рекомбинантных белков. Открытие технологии рекомбинантных ДНК позволило использовать в практической медицине множество белковых и пептидных препаратов, значительно повысив их доступность. В качестве «биологических фабрик» на сегодняшний день используются не только микроорганизмы, но и эукариотические клетки, трансгенные растения и животные, бесклеточные системы. Однако, несмотря на разнообразие методов, гетерологическая экспрессия рекомбинантных генов в клетках E. coli остается одним из самых широко распространенных и популярных методов для получения рекомбинантных белков. Во многих лабораториях мира для получения рекомбинантных белков в первую очередь пытаются экспрессировать рекомбинантный ген в E. coli. Важными характеристиками E. coli как продуцента рекомбинантных белков являются возможность достижения высокой плотности культуры, относительно невысокая стоимость и простота условий культивирования, хорошо изученная физиология и строение генетического аппарата микроорганизма. Применение методов биоинформатики и структурной биологии значительно облегчают создание эффективной экспрессионной системы и планирование процессов выделения и очистки рекомбинантного белка. Однако было бы заблуждением думать, что разработаны универсальные методики экспрессии, подходящие для всех рекомбинантных белков, и процесс их получения – это дорога, ведущая прямо к цели. Для многих белков этот путь тернист и извилист, нужно учитывать и оптимизировать множество параметров для получения искомого продукта.