15. Скрининг рекомбинантных днк библиотек

Ответ. Поиск конкретного фрагмента ДНК среди сотен других последовательностей (скрининг – от англ. Screening) осуществляют с помощью ДНК-зондов. Чаще всего геномная библиотека хранится в E. coli в виде набора бактериальных колоний, каждая из которых содержит различный фрагмент Клетки после трансформации высевают на чашки Петри. Колонии с чашки, например E.coli, переносят на твердую подложку (нитроцеллюлоза), чтобы их расположение соответствовало расположению колоний на чашке. Под действием раствора щелочи бактерии на фильтре лизируются, а ДНК распадается на однонитчатые цепочки. После того как фильтр прогреют при высокой температуре в вакуумной печи, цепи ДНК прочно свяжутся с нитроцеллюлозой. Затем на фильтрнаносят радиоактивно меченную кДНК интересующего гена (меченный зонд 20–100 н). Меченный кДНК-зонд будет комплементарно гибридизоваться только с фрагментом геномной ДНК, содержащим искомый ген. Если на нитроцеллюлозный фильтр положить рентгеновскую пленку, то местоположение метки можно определить по участкам затемнения. Этот метод, называемый ДНК-ДНК гибридизацией, дает возможность узнать, в какой колонии бактерий находится ген. После идентификации отбирают колонию, которая содержит целевую ДНК (ДНК связалась с ДНК-зондом), и анализируют. Если ожидается, что гомология высокая, то в качестве зонда может быть выбран олиго- или полинуклеотид с последовательностью родственного гена. На основании сравнения группы родственных генов в качестве зонда может быть выбран участок с высококонсервативной последовательностью. Если известна последовательность или часть последовательности целевого белка, то на ее основе может быть сконструирован вырожденный зонд. На основании сравнения группы родственных белков может быть выбран участок с высококонсервативной последовательностью и на его основе сконструирован вырожденный зонд. Однако нельзя на основании а/к последовательности определить нуклеотидную последовательность точно. Поэтому создают набор зондов и их используют – это не работает для всех последовательностей, потому что количество вариантов может быть слишком большим. Следующий подход – иммунологический скрининг. Тут вторичные антитела (которые цепляют первичные) несут метку – ферментативную или радиоактивную. Поиск белков по активности. В одном примере в среду добавляется молоко, казеин образует мицеллы, и среда становится мутной. Протеаза же разрушает белок и вокруг колоний с протеазами образуются прозрачные участки. В другом примере в среду добавляется ДНК. Потом чашки обрабатываются соляной кислотой, которая должна осадить ДНК. Однако если в нашей колонии работает ДНКаза, то образуется прозрачный участок на чашке (чтобы лучше эту зону увидеть, можно покрасить зеленым красителем). В этом третьем отбирается наличие липаз. В среду добавляется жир, масло (часто оливковое) + индикатор спиртовой синий, который в кислой среде становится синим, реагируя на образование жирных кислот в ходе работы липазы. Соответвенно, синий цвет – это признак работающей липазы. В четвертом примере отбирается наличие амилаз. В среду добавляется крахмал – если он гидролизуется под действием амилаз, то это легко увидеть, если добавить на чашку раствор Люголя. Прозрачные зоны указывают на активность амилаз. Если клонируемые гены экспрессируются, то для скрининга применяют иммунологические и другие методы, регистрирующие присутствие специфического белка. Иммунологические методы. Эти методы применяют для выявления определенных клонов с рекДНК, если клонируемые гены экспрессируются. Напомним, что молекулы белков имеют по несколько антигенных детерминант (эпитопов), на каждый из которых в организме животных вырабатывается свое антитело (специфический иммуноглобулин). Сыворотки, получаемые стандартными методами, поликлональны, т. е. содержат антитела ко многим эпитопам данного белка. Возможно получение и моноклональных антител, если использовать гибридомы. Хотя моноклональные антитела при скрининге дают небольшой фон ошибочных положительных ответов, используют обычно поликлональные антитела. Это связано с тем, что детектируемый белок может иметь в чем-то измененную структуру или присутствовать в виде фрагмента. Для поиска нужного клона среди небольшого числа колоний применяют метод прямой иммуноселекции. Он предельно прост. На чашки с питательной средой, в которую добавлены антитела к детектируемому белку, высевают клетки, содержащие рекДНК. После образования колоний клетки лизируют и подвергают инкубации. В результате вокруг колоний, содержащих определяемый белок, появляются кольца иммунопреципитации. Лизис клеток осуществляют с помощью фага или лизоцима. Метод радиоиммунодетекции, в котором метка вводится в белки, позволяет выявлять нужные клоны среди 10–20 тысяч колоний на одной чашке Петри. Ранее он основывался на применении поливиниловых дисков, с которыми иммуноглобулины прочно связываются. В современных методах радиоиммунодетекция осуществляется на нитроцеллюлозных фильтрах. Генетический метод возможен, когда клонируемый ген с собственным промотором взят от организма, родственного реципиентным клеткам, и поэтому ожидается его экспрессия. В таком случае, если ген селективен и его признак носит доминантный характер, то соотвествующие клоны отбирают непосредственно в селективных условиях. Если клонируемые гены участвуют в клеточном метаболизме, то реципиентные клетки должны быть дефектными по соответствующему гену, и отбор клонов осуществляют по эффекту генетической комплементации. Рекомбинационный метод основан на использовании гомологической рекомбинации в Е. coli между зондом, интегрированным в плазмиду, и рекомбинантным фагом. Тестирующая последовательность (гомологичная отыскиваемой) длиной не менее 60 п.н предварительно внедряется в вектор nVX (902 п.н.), который содержит полилинкер и ген-супрессор supF. Геномная библиотека, подвергаемая скринингу этим методом, должна быть сконструирована на базе Х-векторов, имеющих супрессор-чувствительные мутации. Описанные методы скрининга – это лишь способ поиска клонов, которые могут содержать целый ген и в которых возможен синтез интактных белков. Судить о целостности клонируемого гена и синтезируемого белка можно только после дополнительного анализа (как правило, после секвенирования).