50. Иммуноблоттинг и иммунодетекция

Ответ. Со времени своего появления в 1979 году блоттинг белков стал обычным инструментом исследовательских лабораторий. Его традиционно используют для обнаружения низких концентраций белков в комплексных образцах или для контроля экспрессии и очистки белков. В самой простой процедуре блоттинга белков, известной как дотблот или слот-блот, используется вакуумная фильтрация для переноса белка на микропористую мембрану. Хотя этот метод обеспечивает качественную информацию об общем уровне экспрессии белков и может выполняться параллельно на нескольких образцах, он не дает информации о молекулярной массе белков. Кроме того, специфичность этого метода может быть поставлена под вопрос, поскольку вместе с интактным белком могут быть обнаружены продукты разложения белка или посттрансляционно модифицированные изоформы. Иммуноблоттинг (Вестерн-блоттинг) применяется для обнаружения специфических белков в геле после электрофоретического разделения. Метод основан на аффинном взаимодействии антител с выявляемыми белками, расположенными в определѐнной полосе в геле среди других белков. Для этого после проведения электрофореза на гель накладывают нитроцеллюлозную мембрану и обеспечивают латеральное перемещение белков из геля на мембрану (процедура блоттинга). Затем мембрану блокируют от неспецифического связывания антител и проводят иммунодетекцию конкретных полос. Локализацию антител, связавшихся с белком обнаруживают в определѐнной точке мембраны, обнаруживают по наличию метки. Антитела могут быть мечены ферментативной либо флуоресцентной меткой. В случает непрямой иммунодетекции специфичные антитела не содержат метки, однако их локализация может быть выявлена обработкой вторичными антителами, связывающимися с тяжѐлыми цепями первичных. Второй подход обладает значительно более высокой чувствительностью. В иммунологическом анализе, или иммунодетекции, для обнаружения и локализации белка, переносимого на мембрану, используются специфичные антитела. Специфичность связывания антиген-антитело позволяет идентифицировать один конкретный белок из комплексного образца При разработке новых протоколов иммунодетекции должны учитываться все компоненты и их взаимодействия. Концентрация антител, буферные смеси, блокирующие агенты и временные параметры инкубации должны быть проверены эмпирически, чтобы определить лучшие условия. На всех этапах важно качество воды – небольшие примеси могут вызвать большие проблемы. Необходимо также принимать во внимание качество блокирующих агентов ос позиций однородности и загрязнений.

51. Введение днк в клетки животных, растений, бактерий, дрожжей

Ответ. Подходы к введению генетических конструкций в клетки: использование векторов; прямое введение. Так как вектора были рассмотрены нами ранее, перейдем сразу к прямым способам введения ДНК в клетки. Способы прямого введения генов в клетку: трансфекция; микроинъекция; электропорация; метод «мини-клеток»; упаковка в липосомы; электронная пушка. Трансфекция. Основана на адсорбции ДНК на кристаллах фосфата кальция, результатом которой является образование частиц кальциевого преципитата, которые поглощаются клетками путем фагоцитоза. Для повышения эффективности трансформации к специфической ДНК, содержащей ген, по которому будет производиться селекция, добавляется неспецифическая ДНК-носитель: ДНК из тимуса теленка или сперма лосося. Часть ДНК связывается с мембраной и не попадает в клетки. ДНК акцептируют от 15 до 90% клеток. Через несколько суток после введения небольшая доля клеток способна экспрессировать чужеродные гены, но затем уровень экспрессии падает и более или менее стабильную трансформацию претерпевает 10-3–10-5 клеток. Для трансфекции используется и ДЭАЭ-декстран – адсорбирует ДНК. Эффект вхождения в клетки и время экспрессии высоки, но частота стабильной трансформации ниже, чем при использовании преципитата кальция. Частоту трансфекции увеличивает глицериновый шок (4 минуты в 15% растворе глицерина в НEPES-буфере). Микроинъекция. Такое введение ДНК в клетки млекопитающих стало доступной с появлением микропипеток (d=0,1–0,5 микрона) и микроманипулятора. Хорошее оборудование позволяет за час инъецировать 500–1000 клеток. При этом успешная интеграция генов наблюдается в 50% клеток. Основные достоинства метода: можно вводить любую ДНК и в любые клетки; для сохранения в клетках введенного гена не требуется никакого селективного давления. Электропорация. Это обратимое увеличение проницаемости мембран клеток, вызываемое импульсами высокого напряжения. В среду добавляются клетки и фрагменты ДНК, предназначенные для введения в клетки. Через нее пропускают импульсы (напряжение 200–350 В) в течение 54 мс. В мембране образуются поры, время существования и размер которых достаточны для прохождения в клетку ДНК под действием осмотических сил. В лучшем случае среди выживших клеток на долю трансформантов приходится 80%. Электропорация – это физический метод, что, вероятнее всего, и стало причиной его широкого применения. По результатам многочисленных исследований установлено, что электропорация может успешно использоваться для введения молекул ДНК в культивируемые клетки животных, простейших, дрожжей, бактерий и протопласты растений. Основные достоинства электропорации: простота; эффективность. «Мини-клетки». При этом способе донорные клетки блокируются в митозе колцемидом, что ведет к образованию в них новых ядерных мембран вокруг каждой хромосомы. Далее клетки обрабатываются цитохалазином В и центрифугируются, после чего и образуются мини-клетки – микроядра, инкапсулированные в цитоплазматическую мембрану, которые характеризуются высокой чувствительностью к разным воздействиям. Этот метод имеет значительные недостатки: трудоемкость; капризность; низкая эффективность – 10-6–10-7. Упаковка в липосомы обеспечивает экзогенному генетическому материалу защиту от рестриктаз. Липосомы – это сферические оболочки, состав которых представлен фосфатидилсерином и холестерином. Способы получения липосом: резкое встряхивание смеси, состоящей из воды и липидов; обработка водной эмульсии фосфолипидов ультразвуком. Липосомы чаще используются при трансформации клеток животных и растений. Этот способ в первую очередь хорош тем, что липосомы нетоксичны относительно клеток. Биологическая баллистика – эффективный способ переноса генетических конструкций в клетки, который к настоящему времени стал самым востребованным в генной инженерии. В качестве носителей векторов со встроенными в них ДНК используются частички вольфрама (d=0,6–1,2 мкм), которые наносятся на целлофановую подложку и помещаются внутрь биолистической пушки. Каллус или суспензия клеток наносится в чашку Петри с агаризированной средой и помещается под биолистическую пушку. Расстояние между ними колеблется от 10 до 15 см. Вакуумный насос пушки уменьшает давление до 0,1 атм. При сбрасывании давления вольфрамовые частички с огромной скоростью выбрасываются и, разрывая клеточные стенки, оказываются в цитоплазме и ядре клеток. Центральные клетки, как правило, погибают. Причиной этому служит огромное количество и давление частиц вольфрама. Выжившие клетки в основном находятся в зоне 0,6–1 см от центра. После баллистики клетки переносятся на среду для дальнейшего культивирования и регенерации.