30. Амплификация рнк с помощью пцр

Ответ. На первом этапе с помощью обратной транскриптазы (ОТ) получают ДНК – копию целевой РНК, а затем осуществляют ПЦР. Такая система называется ОТ-ПЦР. Обратные транскриптазы имеют две основные ферментативные активности: ДНК – полимеразную РНКазы Н. Последняя направлена на гидролиз комплексов РНК-ДНК и поэтому значительно снижает эффективность синтеза кДНК in vitro. Методами генетической инженерии удалось получить варианты обратной транскриптазы с существенно сниженной активностью РНКазы Н и оптимальной активностью для синтеза кДНК. Использование ревертазы связано с некоторыми трудностями. Прежде всего, данный фермент термолабилен и поэтому может быть использован при температуре не выше 42°С. Так как при такой температуре молекулы РНК легко образуют вторичные структуры, то эффективность реакции заметно снижается и по разным оценкам приблизительно равна 5%. Этот недостаток может быть устранен при использовании в качестве обратной транскриптазы термостабильной полимеразы, проявляющей активность в присутствии ионов Мn2+. Это единственный известный фермент, способный проявлять как полимеразную, так и транскриптазную активность. Для проведения реакции обратной транскрипции в реакционной смеси так же, как и в ПЦР, в качестве затравки должны присутствовать праймеры и смесь 4-х дНТФ. Возможность использования РНК в качестве мишени для ПЦР существенно расширяет спектр применения этого метода, например, геномы многих вирусов (гепатит С, вирусы гриппа, ВИЧ и т.д.) представлены именно РНК. Технологии рекомбинантных ДНК – это совокупность процедур, позволяющих осуществить конструирование нового генного комплекса и перенос его в организм-реципиент, где новый генетический материал начинает работать. Не существует единого универсального набора методик, все зависит от конкретной задачи, но чаще всего эксперименты с рекомбинантной ДНК проводят по следующей схеме. Получение нужной последовательности – ДНК для клонирования может быть получена химико-ферментативным синтезом, обратной транскрипцией мРНК и путем непосредственного расщепления геномной ДНК нужной рестрикционной эндонуклеазой. Но самый распространенный путь сейчас – синтез ДНК методом ПЦР. После выбора и синтеза праймеров к известной последовательности, ДНК можно амплифицировать методом ПЦР с использованием, в том числе и вырожденных праймеров (с неполной комплементацией). В качестве матрицы для синтеза используют геномную ДНК или матричную РНК, в этом случае первым шагом в синтезе целевой последовательности будет синтез комплементарной ДНК (кДНК) обратной транскриптазой (ревертазой – РТ), затем обычная ПЦР. Иногда эти реакции объединяют в одну РТ-ПЦР (RTPCR). Как правило, в концы ПЦР-праймеров вводят сайты рестриктаз для удобства дальнейшего клонирования синтезированной последовательности. Нужную последовательность ДНК также можно получить химико-ферментативным синтезом, при этом производят сборку полноразмерного гена из отдельных синтетических олигонуклеотидов различными способами. Химический синтез гена осуществляют, как правило, когда организм-донор ДНК не доступен или когда нуклеотидная последовательность природного гена может плохо транслироваться в выбранном организме-реципиенте вследствие несовпадения частоты использования кодонов, а также по другим причинам. После обработки рестриктазами полученный ген соединяют (лигируют) с клонирующим вектором с образованием новой, рекомбинантной молекулы – конструкция «клонирующий вектор – встроенная ДНК». Вектор для клонирования – общий термин, обозначающий молекулу ДНК, способную к включению чужеродной ДНК и к автономной репликации, служит инструментом для введения генетической информации в клетку. То есть является молекулойносителем, подобно космической ракете-носителю, для клонируемой ДНК. Полученную рекомбинантную конструкцию вводят в клетку-мишень (реципиент), где она реплицируется и передается потомкам. Этот процесс называется трансформацией (в основном для прокариот и дрожжей) и трансфекцией (в случае эукариот). В зависимости от типа вектора и схемы эксперимента рекомбинантная ДНК может либо реплицироваться автономно, либо встроиться в хромосому клетки-хозяина. Используя селективный маркер, идентифицируют и отбирают клетки, несущие рекомбинантную ДНК. Например, высевают трансформированные клетки на селективную среду с антибиотиком, ген устойчивости к которому несет использованный вектор – расти будут только колонии (клоны) рекомбинантных клеток. Получают специфический белковый продукт, синтезированный клетками-хозяевами, что служит подтверждением клонирования искомого гена.