19. Выделение перекрывающихся клонов днк («прогулка по хромомсоме») с целью идентификации соседних генов

Ответ. «Прогулка» по хромосоме — метод анализа протяженных нуклеотидных последовательностей вокруг секвенированных участков генома с использованием «блуждающих» праймеров, который заключается в последовательном отборе клонов, содержащих частично перекрывающиеся фрагменты ДНК из определенного района генома. На первом этапе проводят скрининг библиотеки генов с помощью маркерной ДНК, сцепленной с определенным геном. После нахождения положительных клонов последние сами служат зондами для изоляции других клонов, содержащих перекрывающиеся нуклеотидные последовательности ДНК. Т. обр., каждый раз отобранный фрагмент используется в качестве скринирующего ДНК-зонда для последующего поиска. В результате получают набор клонированных фрагментов ДНК, полностью перекрывающих область поиска гена. Группа подобных клонов носит название «контигов». С помощью физического картирования инсерционных ДНК в разных клонах удается точно установить степень перекрывания между соседними фрагментами и соответственно упорядочить положение клонов в контигах. В результате прогулки с помощью перекрывающихся нуклеотидных последовательностей анализируются неизвестные протяженные участки генома, прилегающие друг к другу. Одним из вариантов метода является метод «прыжков по хромосоме» — один из вариантов метода «прогулок по хромосоме», отличающийся тем, что в результате какой-либо мутации маркерный ген, используемый для скрининга библиотеки генов, перемещается по геному (на ту же или другую хромосому), что позволяет выделять новые сцепленные с ним гены.

20. Выделение и очистка рекомбинантных клонов

Ответ. В зависимости от размера банк генов может состоять из индивидуальных клонов или из их смеси. Получение банка в виде индивидуальных клонов необходимо, когда ставится задача составления геномной энциклопедии. Энциклопедией является геномная библиотека E. coli, составленная в результате анализа 3400 клонов. Полный банк представлен всего 476 клонами, хранящимися в международных и национальных коллекциях. Наиболее стабильно и длительно хранятся банки, полученные с помощью лямбда-векторов. Реконструированные in vitro рекомбинантные фаги быстро инактивируются, поэтому их немедленно рассевают с плотностью около 100 негативных колоний на 1 кв. см. Чашки инкубируют 8–10 часов при 37С, не позволяя образующимся негативным колониям перекрываться. Далее фаги экстрагируют буфером и после ценгрифугирования хранят под хлороформом при 4С многие годы. Способ хранения фагового банка при –70С в ―мягком агаре в 30%-ном глицерине. Амплификация банка необходима для хранения библиотеки или повторного скрининга. Однако при повторных пересевах представительность банка ухудшается из-за различий в скоростях размножения клонов, что обусловлено особенностями их нуклеотидных последовательностей и разницей в длине вставки. Коллекция бактериальных клонов, содержащих рекомбинантные космиды, получается сходным образом. Выросшие на селективных чашках микроколонии (20–30 тысяч на чашку) объединяют и хранят в среде с глицерином при –70С, распределив предварительно в несколько десятков пробирок. Каждая пробирка используется после оттаивания единожды для скрининга или для других процедур. Конечно, и в этом случае возможен немедленный скрининг банка без его амплификации, для чего инфицированные бактерии высевают сразу на гибридизационные фильтры.