7.5. Определение активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови

Лактатдегидрогеназа, ЛДГ (L-лактат: НАД-оксидоредуктаза; КФ 1.1.1.27) – цитоплазматический цинксодержащий гликолитический фермент, обратимо катализирующий восстановление пировиноградной кислоты в молочную кислоту:

Пируват + НАДН(H⁺) ↔ Лактат + НАД⁺

Каждая молекула ЛДГ состоит из четырех субъединиц двух типов: Н (heart) и M (muscle), образующих 5 изоферментов: ЛДГ₁ (Н₄), ЛДГ₂ (Н₃М₁), ЛДГ₃ (Н₂М₂), ЛДГ₄ (Н₁М₃), ЛДГ₅ (М₅).

Наибольшая активность отмечается в почках, печени (ЛДГ₄ и ЛДГ₅), сердце (ЛДГ₁ и ЛДГ₂), скелетных мышцах (ЛДГ₅), поджелудочной железе, клетках крови. В эритроцитах уровень ЛДГ в 100 раз выше, чем в сыворотке. У детей активность фермента выше, чем у взрослых; с возрастом активность ЛДГ сыворотки плавно снижается. Повышенная активность ЛДГ в физиологических условиях наблюдается у беременных, новорожденных, а также после интенсивных физических нагрузок.

Резкое повышение содержания ЛДГ в сыворотке крови отмечается при заболеваниях печени, инфаркте миокарда и инфаркте легкого. Активность ЛДГ сыворотки крови повышается также при заболеваниях системы крови, злокачественных новообразованиях различных органов; заболеваниях почек (гломерулонефриты, пиелонефриты, инфаркт почки и т.п); остром панкреатите. Приём алкоголя и некоторых лекарственных средств (таких, как кофеин, анестетики, цефалоспорины, нестероидные противовоспалительные средства, сульфаниламиды) также могут быть причиной повышения концентрации ЛДГ в сыворотке крови.

Принцип метода

Активность ЛДГ определяют по окислению лактата в пируват. Накапливающийся в реакции НАДН(Н⁺) в присутствии переносчика электронов восстанавливает краситель йоднитротетразолиевый фиолетовый в красный формазан, о концентрации которого судят по оптической плотности раствора при 500 нм.

Выполнение работы (см. приложение )*

Маркируют 4 пробирки и вносят в них следующие реактивы:

	Реактивы и этапы	опыт	контроль-1	стандарт	контроль-2
1.	Буфер ТРИС, содержащий эмульгатор и стабилизатор (рН=8,2), мл	0,2	0,2	0,2	0,2
2.	Субстрат (лактат лития), мл	0,5	–	0,5	–
3.	Раствор этилендиаминтетраацетата натрия, мл	–	0,5	–	0,5
4.	Сыворотка крови, мл	0,05	0,05	–	–
5.	Стандартный раствор ЛДГ, мл	-	-	0,05	0,05
6.	Раствор НАДН(Н+) и красителя, мл	0,2	0,2	0,2	0,2
7.	Перемешивают и инкубируют при 37оC 10 минут
8.	Раствор соляной кислоты, мл	3,0	3,0	3,0	3,0
9.	Фотометрируют против воды (= 500 нм, толщина кюветы 1 см)	D1	D2	D3	D4
		D1 – D2		D3 – D4

*Примечание: поскольку наборы для определения ЛДГ очень дороги, проводят одно определение на группу

Расчет: , где а – коэффициент, соответствующий активности стандартного раствора ЛДГ (4,34 мккат/л).

Норма: 0,66-2,66 мккат/л при 37^оС.

Выводы

Тестовые задания по теме: «Биосинтез нуклеиновых кислот и белков»

1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»

1. Дезоксинуклеотидтрифосфаты - непосредственные субстраты для синтеза ДНК.

2. Процесс транскрипции может регулироваться трийодтиронином.

3. Непосредственным донором метильной группы при синтезе ТМФ является метенил-ТГФК.

4. Все типы РНК синтезируются в ядре.

5. Биосинтез дочерних цепей ДНК осуществляется в направлении 5'3'.

6. Оксилизин и оксипролин - продукты посттрансляционной модификации соответствующих аминокислот.

7. Обеспечивается ли связывание тРНК с аминокислотами аминоацил-тРНК-синтетазами?

8. Могут ли РНК проявлять каталитическую активность?

9. Контролируется ли биосинтез РНК на матрице ДНК стероидными гормонами?

10. Может ли постсинтетическая модификация белков происходить путем фосфорилирования?

11. Различаются ли стадии элонгации в биосинтезе белков и нуклеиновых кислот?

12. Может ли происходить модификация белков путем частичного протеолиза?

2) Выбрать один правильный ответ:

Фермент, синтезирующий аминоацил-тРНК, относится к классу: трансфераз лиаз лигаз (синтетаз) оксидоредуктаз изомераз

Постсинтетическая модификация белков может происходить путем их: фосфорилирования гидроксилирования ограниченного протеолиза ковалентного связывания с простетической группой всеми перечисленными способами

3) Найти соответствие

1. биосинтез белка 2. синтез гема 3. синтез т-РНК

А. митохондрия Б. ядро В. рибосома