6.2. Количественное определение аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы в сыворотке крови
Аспартатаминотрансфераза (АсАТ, КФ: 2.6.1.1) и аланинаминотрансфераза (АлАТ, КФ: 2.6.1.2) – пиридоксальфосфатсодержащие ферменты.
АсАТ катализирует обратимый перенос аминогруппы от аспартата на -кетоглутарат с образованием глутамата и оксалоацетата.
АлАТ катализирует обратимую реакцию переноса аминогруппы от аланина на -кетоглутарат с образованием глутамата и пирувата (ПВК).
АлАТ содержится в цитозоле, тогда как для АсАТ известны 2 формы: цитоплазматическая и митохондриальная.
При поражении тканей аминотрансферазы «вымываются» из поврежденных клеток в кровоток, поэтому определение активности аминотрансфераз в сыворотке крови имеет важное значение, особенно для диагностики поражений сердца и дифференциальной диагностики болезней печени. Так, при неосложненном инфаркте миокарда, уровень АсАТ в сыворотке крови начинает повышаться уже через 4-6 часов после наступления инфаркта, максимум активности приходится на вторые сутки и лишь на 5-8 день активность фермента снижается до нормы. Изменение активности сывороточной АлАТ при этом незначительно.
При инфекционном гепатите (болезни Боткина) и обострении хронического гепатита активности обеих аминотрансфераз в сыворотке крови повышаются (активность АлАТ повышается сильнее). Цирроз печени не сопровождается значительной гиперферментемией.
Цель работы
Определить активности обеих аминотрансфераз в сыворотке крови колориметрическим методом и сравнить полученные результаты с нормой.
Принцип метода
Определение активности обеих аминотрансфераз основано на колориметрическом обнаружении пирувата, образующегося за 1 час инкубации, по цветной реакции с 2,4-динитрофенилгидразином в щелочной среде. В случае АлАТ пируват образуется непосредственно из аланина, а в случае АсАТ пируват образуется из оксалоацетата после декарбоксилирования последнего в щелочной среде:
Аспартат +
-Кетоглутарат
Глутамат + Оксалоацетат
Пируват CO2
Активности обоих ферментов определяют по калибровочному графику.
Выполнение работы1 (см. приложение )
Реагенты, этапы |
Опыт |
Контроль |
Субстрат для АсАТ или АлАТ, мл |
0,25 |
0,25 |
Физиологический раствор, мл |
— |
0,05 |
Сыворотка крови, мл |
0,05 |
— |
Инкубируют 60 минут при 37 С |
||
2,4-Динитрофенилгидразин, мл |
0,25 |
0,25 |
Перемешивают и оставляют на 20 минут при 20 С |
||
Раствор NaOH , мл |
2,5 |
2,5 |
Через 10 мин фотометрируют против Н2О (500 нм, толщина кюветы 0,5 см) D540 |
|
|
Dоп – Dк |
|
|
Расчет активности производят в мккат/л по калибровочному графику:
Активность АлАТ или АсАТ в мккат/л |
Dоп – Dк |
0,1 |
0,025 |
0,2 |
0,05 |
0,3 |
0,08 |
0,4 |
0,11 |
Норма: АлАТ = 0,05 – 0,12 мккат/л; АсАТ = 0,06 – 0,14 мккат/л. Верхний предел – 0,42 мккат/л.
Выводы
Тестовые задания по теме: «Обмен аминокислот»
1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»
Тирозин является незаменимой аминокислотой для человека.
В окислительном дезаминировании аминокислот могут участвовать разные коферменты.
Реакции трансаминирования аминокислот необратимы.
В процессах трансдезаминирования и трансреаминирования аминокислот участвует α-кетоглутаровая кислота.
Коферентом аминотрансфераз служит ФАД.
В процессе трансаминирования выделяется аммиак.
Возможно ли превращение пировиноградной кислоты в аланин в организме человека?
Является ли фенилаланин предшественником серотонина?
Используют ли определение активности аспартатаминотрансферазы в сыворотке крови человека для диагностики инфаркта миокарда?
Нужен ли витамин В1 для реакций трансаминирования?
Усиливается ли глюконеогенез при сахарном диабете?
Участвуют ли лизин и треонин в реакциях трансаминирования?
2) Выбрать один правильный ответ
Метаболит ЦТК, участвующий в реакциях трансаминирования:
|
Гликогенной аминокислотой не является:
|
3) Установить соответствие названия вещества и его предшественника
1. гистамин 2. γ-аминомасляная кислота 3. серотонин 4. таурин 5. дофамин
|
А. тирозин Б. триптофан В. цистеин Г. гистидин Д. глутамат |