- •Российский университет дружбы народов
- •К практическим занятиям по биохимии
- •Авторский коллектив:
- •Предисловие как пользоваться этим учебным пособием?
- •Список сокращений и условных обозначений
- •Техника безопасности при работе в биохимической лаборатории
- •1. Общие требования безопасности
- •Классификация химических реактивов в биохимической лаборатории
- •2. Требования безопасности перед началом работ
- •3. Требования безопасности во время работы
- •4. Требование безопасности в аварийных ситуациях
- •5.Требование безопасности по окончании работы
- •Раздел 1: Аминокислоты и простые белки Введение
- •1.1 Проверка знаний по органической химии
- •1.2. Цветные реакции на белки и аминокислоты. Реакции осаждения и денатурации белков а. Цветные реакции на белки и аминокислоты
- •Б. Реакции осаждения и денатурации белков
- •1.3. Количественное определение белка биуретовым методом. Построение калибровочных кривых
- •1 .4. Диализ белков. Бумажная хроматография аминокислот
- •А. Диализ
- •1.5. Коллоквиум I по теме «Аминокислоты и простые белки»
- •Раздел 2: Сложные белки, нуклеиновые кислоты и ферменты Введение
- •2.1 Действие амилазы на крахмал. Влияние температуры на активность амилазы а. Действие амилазы на крахмал
- •Б. Изучение влияния температуры на скорость ферментативной реакции
- •2.2. Количественное определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови с п-нитрофенилфосфатом
- •2.3. Коллоквиум II по теме: «Сложные белки, нуклеиновые кислоты и ферменты» Вопросы, для самостоятельной подготовки
- •Варианты письменной части коллоквиума
- •Варианты заданий на компьютерном тестировании
- •Правильные ответы
- •Раздел 3: Витамины, липиды, гормоны Введение
- •3.1. Количественное определение витаминов с и р.
- •3.3. Влияние гормонов на содержание глюкозы в крови
- •3.4. Коллоквиум III по теме «Витамины, липиды, гормоны»
- •Раздел 4: Метаболизм. Биоэнергетика клеток. Химия и обмен углеводов Введение
- •4.1. Специфичность действия ферментов распада углеводов: амилазы и сахаразы
- •4.2. Количественное определение глюкозы. Построение «сахарных кривых»
- •4.3. Определение активности сукцинатдегидрогеназы в мышцах. Количественное определение пирувата в моче
- •4.4 Коллоквиум IV по теме: «Метаболизм. Биоэнергетика клеток. Химия и обмен углеводов»
- •Правильные ответы
- •Раздел 5: Обмен липидов и его регуляция Введение
- •5.1. Кинетика действия липазы.
- •5.2. Количественное определение фосфатидилхолинов (лецитинов) по фосфору
- •I. Приготовление рабочего раствора сыворотки.
- •II. Определение концентрации фосфатидолхолинов по содержанию фосфора.
- •5.3. Количественное определение холестерина в сыворотке крови
- •5.4. Количественное определение малонового диальдегида
- •5.5. Коллоквиум по теме «Обмен липидов»
- •Раздел 6: Переваривание белков и обмен аминокислот
- •6.1. Количественный анализ желудочного сока. Определение свободной, связанной, общей соляной кислоты и общей кислотности желудочного сока.
- •6.2. Количественное определение аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы в сыворотке крови
- •6.3. Доказательство проявления активности аланин-аминотрансферазы (АлАт) методом бумажной хроматографии
- •6.4. Экспресс-метод определения повышенного содержания фенилаланина в плазме крови
- •6.5. Количественное определение мочевины в моче ферментативным уреазным/фенол-гипохлоритным методом
- •6.6. Количественное определение креатинина в моче
- •6.7. Коллоквиум по теме: «Обмен простых белков» Вопросы, для самостоятельной подготовки
- •Варианты письменной части коллоквиума
- •Правильные ответы
- •Раздел 7: Обмен хромопротеинов и нуклеопротеинов. Биохимия крови и мочи. Биосинтез нуклеиновых кислот и белков. Введение
- •7.1. Определение общего билирубина в сыворотке крови
- •7.2. Количественное определение мочевой кислоты в моче
- •7.3. А. Определение активности -амилазы в моче
- •7.3. Б. Составные части мочи в норме и при патологии
- •7.4. Определение активности холинэстеразы в сыворотке крови
- •7.5. Определение активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови
- •7.6. Коллоквиум по теме: «Обмен хромопротеинов и нуклеопротеинов. Биохимия крови и мочи. Биосинтез нуклеиновых кислот и белка». Вопросы, для самостоятельной подготовки
- •Варианты письменной части коллоквиума
- •Правильные ответы
- •Раздел 8: Подготовка к экзамену
- •8.1. Основные вопросы, выносимые на обсуждение
- •8.2. Пример экзаменационного тестового задания по курсу биохимии
- •59. Найти соответствие между процессом и его графическим изображением
- •60. Цикл мочевинообразования установил
- •Ответы к экзаменационному тесту
- •Раздел 9: Приложения
- •9.1. Термины, различающиеся по смыслу, но сходные по написанию и звучанию
- •9.2. Стандартные биохимические наборы и реактивы, используемые в практикуме
- •9.3. Рекомендуемая литература
- •Содержание
- •Раздел 7: Обмен хромопротеинов и нуклеопротеинов. Биохимия крови и мочи. Биосинтез нуклеиновых кислот и белков. 126
- •Раздел 8: Подготовка к экзамену 148
- •Раздел 9: Приложения 161
6.3. Доказательство проявления активности аланин-аминотрансферазы (АлАт) методом бумажной хроматографии
Аланинаминотрансфераза (АлАТ), как и другие аминотрансферазы, участвует во взаимном превращении -аминокислот и -кетокислот в цитозоле клетки.
Аланин + -Кетоглутарат Пируват + Глутамат
Поэтому активность АлАТ можно определить качественно по появлению в реакционной смеси новой аминокислоты, образовавшейся в результате переноса аминогруппы от аланина или глутамата на -кетоглутарат или пируват соответственно (в зависимости от того в каком направлении проводится реакция).
Цель работы
Методом бумажной хроматографии показать наличие активности АлАТ и определить, какая аминокислота (аланин или глутамат) присутствовала в исходной субстратной смеси, то есть в каком направлении проводилась ферментативная реакция.
Принцип метода.
Поскольку в результате ферментативной реакции образуется новая аминокислота, осуществляют идентификацию исходной и образующейся под действием АлАТ аминокислот методом радиальной бумажной хроматографии (см. работу 1.4.Б «Хроматографическое разделение аминокислот»). Идентификацию проводят после окраски нингидрином по сравнению величин Rf исследуемых АМК со стандартными, которые разделяют одновременно в тех же условиях. Для решения задачи необходимо провести три независимых хроматографических разделения: 1) субстратной смеси (одна аминокислота); 2) субстратной смеси + АлАТ (образуется вторая аминокислота); 3) стандартного раствора аланина и глутамата для идентификации.
Выполнение работы
Берут три диска хроматографической бумаги диаметром 12 см. Простым карандашом сверху обозначают фамилию студента и номер диска. В центре каждого диска обводят круг диаметром 0,3-0,4 см. Микропипеткой в центр дисков наносят реактивы, как указано в таблице.
Диски |
I субстрат |
II cубстрат + фермент |
III стандарт |
Реактивы |
|||
Субстратная смесь (аминокислота + кетокислота) |
2 мкл |
2 мкл |
— |
Стандартная смесь (глутамат + аланин) |
— |
— |
2 мкл |
Раствор АлАТ |
— |
2 мкл |
— |
Число окрашенных зон и характер окраски |
|
|
|
Rf для каждой зоны аминокислоты |
|
|
|
Через 10 минут после нанесения последнего реагента (время инкубации) все три диска подсушивают на воздухе. На каждом диске от края к центру делают ножницами два параллельных разреза (ширина разреза равна диаметру кружочка в центре диска). Вырезанную полоску отгибают перпендикулярно диску так, чтобы линия сгиба проходила через середину зоны нанесения растворов. «Ножку» укорачивают до 2-3 см, и диск помещают между нижней и верхней половинками чашки Петри, содержащей смесь бутанол + уксусная кислота + Н2О в соотношении 5:1:4. Проводят хроматографическое разделение под тягой приблизительно в течение 1 часа. Диски извлекают из хроматографической камеры и обводят фронт растворителя простым карандашом. Высушивают в сушильном шкафу при 100С, смачивают раствором нингидрина и снова высушивают1.
Рассчитывают величину Rf для каждой окрашенной зоны и проводят идентификацию аминокислот. Делают вывод о том, какая аминокислота находилась в субстратной смеси. Затем вырезают сегменты из каждого диска и складывают их вместе рядом, совмещая центральные зоны нанесения вещества.
Пояснение к рисунку: Ала – аланин Глу – глутаминовая кислота
Выводы