6.5. Количественное определение мочевины в моче ферментативным уреазным/фенол-гипохлоритным методом

Мочевина – основной конечный продукт обмена белков в организме человека. На долю мочевины приходится 80-90% выделяемого с мочой азота.

Биологическая роль синтеза мочевины в печени (орнитиновый цикл мочевинообразования Кребса) заключается в связывании образующегося при дезаминировании аминокислот аммиака в относительно малотоксичную молекулу мочевины, которая затем экскретируется с мочой.

Зная количество экскретируемой за сутки мочевины и количество азота, поступающего с пищей, можно вычислить азотистый баланс, который является важным показателем состояния белкового и аминокислотного обмена. Азотистый баланс может быть:

1. положительным – у детей, у выздоравливающих после тяжелой болезни;

2. отрицательным – при тяжелых заболеваниях, в том числе онкологических, при голодании и в старческом возрасте;

3. равным нулю (азотистое равновесие) – у здоровых взрослых людей (при нормальном питании).

Всякое повышение белкового обмена, процессы интенсивного распада белка (опухоли, гипертиреоз, диабет) сопровождаются усилением мочевинообразования и увеличением количества мочевины, выделяемой с мочой за стуки. Патологические изменения печени, приводящие к ее функциональной недостаточности, а, следовательно, нарушению синтеза мочевины, сопровождаются понижением количества мочевины в крови и моче. Функциональная недостаточность почек ведет к понижению количества мочевины в моче и одновременному повышению ее содержания в крови (уремия). Некоторые формы диабета, характеризующиеся повышенным аппетитом и прогрессирующим исхуданием больного, сопровождаются повышением выделения мочевины с мочой за счет усиленного распада белков.

Цель работы

Определить содержание мочевины в суточной моче и сравнить с нормой.

Принцип метода

Метод – ферментативный, основан на реакции расщепления молекулы мочевины под действием высокоспецифического фермента – уреазы – до аммиака и углекислого газа, которые в водном растворе образуют карбонат аммония.

Ионы аммония в присутствии нитропруссида натрия реагируют с фенолом и гипохлоритом натрия. В результате реакции образуется индофенол (синего цвета), интенсивность окрашивания которого пропорциональна концентрации ионов аммония (и, соответственно, мочевины).

Выполнение работы (см. приложение )

Для исследования берут следующие пробы (3 промаркированные пробирки): опыт (разведенная моча), стандарт (стандартный раствор мочевины 0,03 г/л) и контроль (вода). Все реактивы вносят, согласно описанию в таблице:

Реактивы и этапы	Опыт	Стандарт	Контроль
Моча 1:1000, мл	0,1	—	—
Стандарт 0,03 г/л, мл	—	0,1	—
Вода дистиллированная, мл	—	—	0,1
Раствор уреазы, мл	0,1	0,1	0,1
Перемешивают. Инкубируют 5 минут при 20С.
Фенол + нитропруссид натрия, мл	1,0	1,0	1,0
Щелочной раствор гипохлорита натрия, мл	1,0	1,0	1,0
Вода дистиллированная (мл)	1,0	1,0	1,0
Перемешивают. Инкубируют 15 минут при 37С.
Фотометрируют против Н2О ( = 540 нм, толщина кюветы 0,5 см). D540
Dоп - Dк
Dст - Dк

На студенческую группу ставят 2 контроля и 2 стандарта. Остальные студенты делают опытные пробы.

Расчет по стандарту мочевины¹

m(мочевины) = г (за сутки)

Зная массовую долю () азота в мочевине, (N) = = 0,47

(где 60 – относительная молекулярная масса мочевины (Mr); 14 – относительная атомная масса азота), можно рассчитать массу азота мочевины за сутки:

m(N) = m(мочевины) ∙ 0,47 г (за сутки)

Норма: масса азота – 12-17 г/сутки

масса мочевины – 25-35 г/сутки

Выводы

Тестовые задания по теме: «Пути обезвреживания аммиака в организме человека и животных»

1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»

1. Глутаминсинтетаза относится к классу лигаз.

2. Выведение мочевины с мочой в количестве 20 - 35 мг/сутки является нормой.

3. Образование карбамоилфосфата в синтезе мочевины требует затраты двух молекул АТФ.

4. Креатин в норме выводится с мочой.

5. Аргиназа катализирует образование оксида азота.

6. Аминогруппа аспартата служит одним из источников азота в молекуле мочевины.

7. Являются ли аминокислоты единственным источником аммиака в организме?

8. Может ли азот амидной группы глутамина включаться в молекулу мочевины?

9. Расходуется ли АТФ в глутаминсинтетазной реакции?

10. Нормально ли для человека выделение 1г креатинина за сутки?

11. Участвует ли метионин в синтезе креатина?

12. Выводится ли ион аммония с мочой?

2) Выбрать один правильный ответ

Аммиак в клетках мозга обезвреживается путем: синтеза мочевины образования солей аммония превращения глутамата в глутамин синтеза креатина всеми перечисленными способами

Цикл мочевинообразования происходит в: почках печени надпочечниках мочевом пузыре поджелудочной железе

3) Установить соответствие Х (цифра) и Y (буква)

Y
Х	мочевина + орнитин
1. цитруллин 2. аргинин 3. фумарат		А. уреаза Б. аргиназа В. фумараза