7.1. Определение общего билирубина в сыворотке крови

Билирубин – промежуточный продукт распада гема и основной желчный пигмент человека. Образование большей части билирубина (около 85%) происходит при распаде гемоглобина эритроцитов, а остальные 15 % билирубина образуются при распаде гема миоглоглобина, цитохромов, каталазы, пероксидазы и других гемопротеинов.

Различают две формы билирубина:

1. свободный (неконъюгированный, непрямой) билирубин токсичен (особенно для мозга), плохо растворим в воде и связывается сывороточным альбумином (транспортная форма в крови).

2. связанный (конъюгированный, прямой) билирубин образуется в печени конъюгацией с УДФ-глюкуроновой кислотой. В результате образуется нетоксичный, хорошо растворимый в воде диглюкуронид билирубина выводимый из организма.

Суммарно, обе эти формы определяют как общий билирубин.

Определение в клинике содержания билирубина в крови (непрямого, прямого, общего), а также уробилиногена в моче используют для дифференциальной диагностики желтух различной этиологии.

Цель работы

Определить концентрацию общего билирубина в сыворотке крови и сравнить полученный результат с нормальными величинами.

Принцип метода

Общий билирубин определяют реакцией с диазотированной сульфаниловой кислотой после диссоциации свободного билирубина в присутствии кофеинового реагента. В результате реакции образуется азосоединение розового цвета, которое после добавления щелочного буфера меняет окраску на зеленую. Контроль не содержит нитрита натрия, необходимого для диазотирования сульфаниловой кислоты. Оптическая плотность растворов, измеренная при 578 нм, пропорциональна содержанию билирубина в пробе.

Выполнение работы (см. приложение )

Реактивы	Опыт	Контроль
Сульфаниловая кислота, мл	0,2	0,2
Раствор нитрита натрия , мл	0,05	-
Кофеиновый реагент , мл	1,0	1,0
Сыворотка , мл	0,2	0,2
Тщательно перемешивают и инкубируют 20 минут при комнатной температуре
Щелочной буфер , мл	1,0	1,0
Тщательно перемешивают и инкубируют 10 минут при комнатной температуре
Фотометрируют против Н2О ( = 578 нм, толщина кюветы 0,5 см) D578
Dоп - Dк

Концентрацию общего билирубина рассчитывают по формуле:

С_{(билирубина)} = 183 ^. (Dоп – Dк) мкмоль/л или

С_{(билирубина)} = 10,7 ^. (Dоп – Dк) мг/дл

(183 и 10,7 – пересчетные коэффициенты для получения концентрации билирубина в соответствующих единицах – см. Rendox, Manual procedures, Edition III, Bilirubin, Colorimetric Method)

Норма: взрослые: 8,5-20,5 мкмоль/л (0,5 – 1,2 мг/дл)

дети: 17-200 мкмоль/л (1,0 – 11,7 мг/дл)

Выводы

Тестовые задания по теме: «Синтез и распад гема»

1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»

1. Амидный азот глутамина может использоваться для синтеза гема.

2. Синтез гема происходит в цитоплазме клеток.

3. Ацетил-КоА необходим для синтеза гема.

4. Прямой билирубин - это моно- или диглюкуронид билирубина.

5. Непрямой билирубин входит в состав желчных камней.

6. Железо для синтеза гема запасается в ферритине.

7. Регулируется ли биосинтез гема по типу обратной связи?

8. Является ли δ-аминолевулинатсинтаза аллостерическим ферментом?

9. Образуется ли стеркобилиноген в печени?

10. Окрашен ли билирубин?

11. Нужен ли глицин для биосинтеза гема?

12. Выводится ли биливердин с мочой?

2) Выбрать один правильный ответ

Продукты распада гема: желчные кислоты желчные пигменты протопорфирины уропорфирины все вышеперечисленные соединения

Коферментом -аминолевулинатсинтазы является: ФАД НАД+ ПФ ТПФ тетрагидробиоптерин

3) Найти соответствие процесса и участвующего в нем метаболита

1. синтез гема 2. распад гема 3. синтез пиримидиновых нуклеотидов 4. распад пиримидиновых нуклеотидов 5. распад пуриновых нуклеотидов

А. Ксантин Б. Уропорфиноген В. Биливердин Г. Оротовая кислота Д. β-аланин