7.4. Определение активности холинэстеразы в сыворотке крови

Холинэстераза – это фермент, который катализирует гидролиз эфиров холина:

(СН₃)₃-N⁺-СН₂-СН₂-О-С(О)-СН₃ (СН₃)₃-N⁺-СН₂-СН₂-ОН + СН₃СООН

Различают два типа холинэстераз, которые обозначают как истинную холинэстеразу (ацетилхолинэстераза) и псевдохолинэстераза (холинэстераза – ХЭ). Истинная холинэстераза (ацетилхолингидролаза, КФ 3.1.1.7.) отличается узкой субстратной специфичностью, гидролизует преимущественно ацетилхолин. Псевдохолинэстераза (ацетилхолин-ацилгидролаза, КФ 3.1.1.8.) обладает более широкой субстратной специфичностью и гидролизует другие эфиры холина.

Истинная холинэстераза локализована в эритроцитах, мышечной и нервной тканях, играет важную роль в передаче нервного импульса путем разрушения ацетилхолина в нервных синапсах и в нервно-мышечном сопряжении.

Псевдохолинэстераза присутствует в сыворотке крови, печени, поджелудочной железе и других внутренних органах.

При заболеваниях и поражениях печени активность холинэстеразы в сыворотке крови снижается, т.к. нарушается синтез фермента гепатоцитами. Низкий уровень ХЭ может наблюдаться при раковых заболеваниях, острых инфекциях, инфаркте миокарда, беременности, а также у курильщиков.

Активность ХЭ сыворотки крови снижается при отравлениях фосфорорганическими соединениями, инсектицидами, нервно-паралитическими газами или другими сходными по химическому строению веществами, которые являются сильными ингибиторами ХЭ.

Повышенный уровень ХЭ может наблюдаться при интенсивных физических тренировках, а также при приеме ряда терапевтических препаратов.

Цель работы

Определить активность фермента холинэстеразы в сыворотке крови и сравнить с нормой.

Принцип метода

В ходе реакции, катализируемой холинэстеразой, образуется уксусная кислота, что приводит к снижению рН реакционной среды. Если проводить реакцию в присутствии индикатора (м-нитрофенола), то при понижении рН наблюдается обесцвечивание раствора, пропорциональное ферментативной активности ХЭ. Для определения фонового оптического поглощения готовят контрольный раствор, в котором холинэстеразную активность сыворотки ингибируют прозерином. При 400 нм измеряют оптическую плотность в контрольной и опытной пробах, и их разность используют для вычисления активности ХЭ по калибровочному графику зависимости D_к–D_оп от активности ХЭ. За единицу активности холинэстеразы (ед.) принимают такое количество фермента, которое катализирует образование 1 мкмоль уксусной кислоты из ацетилхолина за 10 мин при 25^оС.

Прозерин

Выполнение работы (см. приложение )

Маркируют две пробирки и вносят в них последовательно (перемешивая содержимое пробирок после добавления каждого реагента):

	Этапы и реактивы	Опыт	Контроль
1.	Физиологический раствор, мл	0,2	0,2
2.	Сыворотка крови, мл	0,2	0,2
3.	Прозерин, мл	-	0,2
4.	Ацетилхолин, мл	0,2	0,2
5.	Н2О, мл	3,0	2,8
6.	Инкубируют 10 минут при температуре 25С
7.	Раствор м-нитрофенола, мл	2,0	2,0
8.	Фотометрируют против Н2О ( = 400 нм, толщина кюветы 1 см) D400	Do	Dк
9.	Dк–Dоп

Определяют активность холинэстеразы по калибровочному графику зависимости D_к–D_оп от активности ХЭ.

Калибровочный график

Активность холинэстеразы, ед.	Dк – Doп
20 40 60 80 100 120	0,08 0,12 0,20 0,25 0,30 0,35

Норма: 40-120 единиц.

Выводы

Тестовые задания по теме: «Нормальные и патологические составные части крови и мочи»

1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»

1. Креатин в норме определяется в сыворотке крови и моче.

2. Содержание холестерина и мочевины в крови (ммоль/л) сопоставимо с содержанием глюкозы.

3. В сыворотке крови в норме больше пировиноградной кислоты, чем молочной.

4. Содержание глутамина в сыворотке крови (мкмоль/л) сопоставимо с концентрацией аланина.

5. Общий билирубин определяется как в сыворотке крови, так и в моче.

6. Протеинурия может выражаться в появлении в моче альбуминов.

7. Возможно ли выведение ацетоновых тел с мочой более 100 г/сутки при сахарном диабете?

8. Является ли фосфатидилхолин нормальным компонентом сыворотки крови?

9. Атерогенны ли ЛПВП?

10. Нормально ли выведение 10 г/сутки хлористого натрия с мочой?

11. Сопоставимо ли суточное выведение мочевины, креатинина и мочевой кислоты с мочой?

12. Присутствует ли стеркобилин в моче?

2) Выбрать один правильный ответ

Азот пиримидиновых оснований выводится из организма в основном в виде: мочевой кислоты креатинина β-аланина мочевины креатина

Патологическими компонентами мочи не являются: белки кетоновые тела глюкоза сульфаты билирубин

3) Установить соответствие между поражённым органом и повышением активности фермента в сыворотке крови

1. инфаркт миокарда 2. поражение клеток печени 3. воспаление поджелудочной железы 4. карцинома предстательной железы

А. орнитинкарбамоилтрансфераза Б. амилаза В. кислая фосфатаза Г. креатинкиназа