5.2. Количественное определение фосфатидилхолинов (лецитинов) по фосфору
Фосфатидилхолины (лецитины) – это холиновые производные фосфатидной кислоты. Сочетание гидрофобных и гидрофильных участков в молекуле придает им амфифильные свойства.
Благодаря амфифильным свойствам фосфатидилхолины образуют гидрофильную оболочку жировых мицелл и обеспечивают всасывание высших жирных кислот и МАГ в кишечнике путем диффузии. Фосфатидилхолины входят в состав липопротеинов – транспортных форм липидов. При этом, липопротеины низкой (ЛПНП) и высокой (ЛПВП) плотности содержат соответственно 11-17 % и 24-40 % фосфолипидов, основную часть которых составляют фосфатидилхолины. Фосфатидилхолины служат основными компонентами биомембран, наиболее богаты ими клетки мозга, нервной ткани, сердца и печени.
Повышение уровня ЛПНП наблюдается при гиперлипопротеинемии II типа (семейная гиперхолестеринемия), гиперкортицизме, сахарном диабете, гипотиреозе. Понижение уровня ЛПНП происходит при синдроме мальабсорбции, муковисцидозе, тяжелом голодании. Количество ЛПВП повышается при хроническом алкоголизме и снижается при обтурационной желтухе, лимфогрануломатозе. Снижение интенсивности обмена фосфолицеридов в мозге имеет место при инсулиновой коме. Недостаток холина или метионина нарушает синтез фосфатидилхолинов в печени, что приводит к жировой инфильтрации печени.
Цель работы
Определить содержание фосфатидилхолинов в сыворотке крови и сравнить с нормой.
Принцип метода
Количество фосфатидилхолинов рассчитывают по содержанию фосфора. Сначала из пробы удаляют белки и экстрагируют фосфолипиды спиртом. Затем оставшиеся органические вещества разрушают путем минерализации в присутствии концентрированной серной кислоты. При этом, углерод превращается в СО2, водород в Н2О, азот в сульфат аммония, фосфор в анион фосфорной кислоты. После добавления пероксида водорода азот удаляется в виде летучих оксидов, и в пробе остается только нелетучий фосфор и его оксиды, количество которых определяют фотометрически в реакции с молибдатом аммония в присутствии аскорбиновой кислоты по калибровочному графику.
Выполнение работы
I. Приготовление рабочего раствора сыворотки.
1. Депротеинизация сыворотки крови. В пробирку наливают 2 мл сыворотки крови и 5 мл спирта, перемешивают стеклянной палочкой, нагревают на водяной бане (800С) в течение 10 мин. Пробирку охлаждают и содержимое фильтруют через сухой фильтр в сухую пробирку.
2. Минерализация. Фильтрат (1 мл) переносят в тугоплавкую колбу Кьельдаля для сжигания и добавляют осторожно по стенкам колбы 10 капель концентрированной H2SO4. Через 15 минут после начала сжигания, в колбу Кьельдаля добавляют несколько капель пероксида водорода и продолжают нагревать до просветления жидкости. Колбу охлаждают и содержимое количественно переносят в мерную пробирку. Эти две стадии делаются предварительно, и студентам предлагается начать с нейтрализации полученного раствора.
3. Нейтрализация. Содержимое мерной пробирки доводят по бумажке с универсальным индикатором до рН = 7,0 (светло-зеленый цвет) 10%-ным раствором щелочи. В случае добавления избытка щёлочи проводят нейтрализацию 10%-ым раствором серной кислоты.