5.4. Количественное определение малонового диальдегида

Свободными радикалами (R^) называют атомы, молекулы или структурные фрагменты молекул, имеющие на внешних орбиталях неспаренные электроны. В силу исключительно высокой реакционной способности радикалы могут взаимодействовать с различными молекулами, вызывая их повреждение. Малоновый диальдегид (МДА) – конечный продукт свободно-радикального окисления полиненасыщенных высших жирных кислот, входящих в состав фосфолипидов биологических мембран. МДА – химически очень активное вещество, своими альдегидными группами взаимодействует с NH₂-группами белков, вызывая их необратимую денатурацию.

Активация в клетке пероксидных и свободно-радикальных процессов – это один из факторов патогенеза атеросклероза, ишемической болезни сердца, инфаркта, инсульта, язвенной и ожоговой болезни, онкологических, воспалительных и инфекционных заболеваний, синдрома адаптационного перенапряжения и хронической усталости, диабета. Синдром пероксидации проявляется также при низком уровне антиоксидантов, стрессе любого происхождения, действии синтетических лекарств и ксенобиотиков, гиподинамии, старении организма, избыточном потреблении в пищу жиров и углеводов, гипоксических состояниях, воздействии вибрации, электромагнитных полей, радиоактивного и ультрафиолетового излучений.

Цель работы

Определить содержание МДА в сыворотке крови

Принцип метода

МДА реагирует с тиобарбитуровой кислотой. При этом образуется окрашенное соединение - триметиловый комплекс. Оптическую плотность окрашенного раствора определяют на ФЭК при 532 нм и рассчитывают концентрацию МДА исходя из молярного коэффициента экстинции триметилового комплекса.

Выполнение работы

Студентам выдается готовый лизат, приготовленный следующим образом: к 2 мл крови добавляют 0.2 мл 0.1% раствора Тритон Х-100 и оставляют на 30 минут при 0С. МДА определяют в образовавшемся лизате по ниже приведённой схеме:

Реактивы и этапы	Пробы
	Опыт	Контроль
Лизат, мл	0,5	–
Физиологический раствор, мл	1,5	2
Трихлоруксусная кислота (30% ТХУ), мл	2	2
Инкубируют 15 минут при 0С
Центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин
Надосадочную жидкость аккуратно сливают в помеченные стеклянные пробирки, отбирают из них точно по 2 мл надосадочной жидкости и добавляют:
Тиобарбитуровая кислота (0,5%), мл	4	4
Кипятят 15 минут (осторожно!)
Охлаждают до 15–25 С
Фотометрируют против воды (=532 нм, толщина кюветы 1 см ) D532
Dоп – Dк

Расчет результатов

Концентрацию МДА (C_x) вычисляют по формуле:

C_x = 76,92 · (Dоп – Dк) мкмоль/л

Примечание: 76,92 – рассчитывается исходя из молярного коэффициента экстинкции триметилового комплекса (1,56 ^. 10⁵ моль^-1см^-1) и разведения.

Выводы:

Тестовые задания по теме: «Обмен липидов»

1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»

1. В организме животных встречаются в основном жирные кислоты с четным числом углеродных атомов.

2. Фосфатидилхолин содержит остаток серина в составе своей молекулы.

3. Карнитин осуществляет транспорт активированных жирных кислот в митохондрии.

4. Желчные кислоты синтезируются в печени.

5. В биосинтезе фосфатидилхолина участвует ЦТФ.

6. В состав парных желчных кислот может входить глицин.

7. Синтезируются ли в организме гормоны липидной природы?

8. Велико ли содержание холестерина в хиломикронах?

9. Может ли глицерин превращаться в диоксиацетонфосфат?

10. Нужен ли восстановленный НАДФН (Н⁺) для биосинтеза холестерина?

11. Является ли скавален циклическим соединением?

12. Может ли ацетон образоваться из ацетоуксусной кислоты?

13. Ацетил-КоА - единственный источник образования ацетоновых тел в организме.

14. Ацетоацетат является дополнительным источником энергии в клетках печени.

15. Донором метильных групп для синтеза фосфатидилхолина является метионин.

16. Ненасыщенные жирные кислоты синтезируются значительно быстрее, чем насыщенные.

17. НАДФН (Н⁺) является коферментом β-гидрокси-β-метилглутарил-КоА- редуктазы.

18. Энергетический выход полного окисления глюкозы меньше по сравнению с окислением капроновой кислоты.

19. Является ли фосфатидная кислота общим метаболитом в синтезе триацилглицеролов и фосфатидилхолина?

20. Активируется ли липаза жировой ткани цАМФ?

21. Являются ли пальмитоил-КоА и серин источником синтеза сфинголипидов?

22. Активирует ли адреналин липолиз в жировой ткани?

23. Может ли ацетил-КоА превращаться в глюкозу в организме человека?

24. Ингибирует ли малонил-КоА карнитиновый транспорт высших жирных кислот в митохондрии?

2) Выбрать один правильный ответ

2.1.

Факторы, тормозящие липолиз в жировой ткани: катехоламины и соматотропин глюкокортикоиды стресс, физическая нагрузка, голодание глюкагон и кортикотропин инсулин и простагландины

В синтезе фосфатидилхолина принимает участие: цистеин метионин треонин глицин аланин

2.2.

Участник биосинтеза жирных кислот: карнитин биотин сфингозин церулоплазмин ФАДН2

Конечный продукт действия синтазы жирных кислот: бутирил-КоА бутирил-АПБ пальмитиновая кислота стеариновая кислота пальмитоил-КоА

3) Установить соответствие Х (цифра) и Y(буква):

СО₂ + Х Малонил- КоА

Х	Y
1. Сукцинил-КоА 2. Ацетил -КоА 3. Ацетоацетил-КоА	А. Ацил-КоА-дегидрогеназа Б. Кетоацил-АПБ-редуктаза В. Ацетил-КоА-карбоксилаза