- •Российский университет дружбы народов
- •К практическим занятиям по биохимии
- •Авторский коллектив:
- •Предисловие как пользоваться этим учебным пособием?
- •Список сокращений и условных обозначений
- •Техника безопасности при работе в биохимической лаборатории
- •1. Общие требования безопасности
- •Классификация химических реактивов в биохимической лаборатории
- •2. Требования безопасности перед началом работ
- •3. Требования безопасности во время работы
- •4. Требование безопасности в аварийных ситуациях
- •5.Требование безопасности по окончании работы
- •Раздел 1: Аминокислоты и простые белки Введение
- •1.1 Проверка знаний по органической химии
- •1.2. Цветные реакции на белки и аминокислоты. Реакции осаждения и денатурации белков а. Цветные реакции на белки и аминокислоты
- •Б. Реакции осаждения и денатурации белков
- •1.3. Количественное определение белка биуретовым методом. Построение калибровочных кривых
- •1 .4. Диализ белков. Бумажная хроматография аминокислот
- •А. Диализ
- •1.5. Коллоквиум I по теме «Аминокислоты и простые белки»
- •Раздел 2: Сложные белки, нуклеиновые кислоты и ферменты Введение
- •2.1 Действие амилазы на крахмал. Влияние температуры на активность амилазы а. Действие амилазы на крахмал
- •Б. Изучение влияния температуры на скорость ферментативной реакции
- •2.2. Количественное определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови с п-нитрофенилфосфатом
- •2.3. Коллоквиум II по теме: «Сложные белки, нуклеиновые кислоты и ферменты» Вопросы, для самостоятельной подготовки
- •Варианты письменной части коллоквиума
- •Варианты заданий на компьютерном тестировании
- •Правильные ответы
- •Раздел 3: Витамины, липиды, гормоны Введение
- •3.1. Количественное определение витаминов с и р.
- •3.3. Влияние гормонов на содержание глюкозы в крови
- •3.4. Коллоквиум III по теме «Витамины, липиды, гормоны»
- •Раздел 4: Метаболизм. Биоэнергетика клеток. Химия и обмен углеводов Введение
- •4.1. Специфичность действия ферментов распада углеводов: амилазы и сахаразы
- •4.2. Количественное определение глюкозы. Построение «сахарных кривых»
- •4.3. Определение активности сукцинатдегидрогеназы в мышцах. Количественное определение пирувата в моче
- •4.4 Коллоквиум IV по теме: «Метаболизм. Биоэнергетика клеток. Химия и обмен углеводов»
- •Правильные ответы
- •Раздел 5: Обмен липидов и его регуляция Введение
- •5.1. Кинетика действия липазы.
- •5.2. Количественное определение фосфатидилхолинов (лецитинов) по фосфору
- •I. Приготовление рабочего раствора сыворотки.
- •II. Определение концентрации фосфатидолхолинов по содержанию фосфора.
- •5.3. Количественное определение холестерина в сыворотке крови
- •5.4. Количественное определение малонового диальдегида
- •5.5. Коллоквиум по теме «Обмен липидов»
- •Раздел 6: Переваривание белков и обмен аминокислот
- •6.1. Количественный анализ желудочного сока. Определение свободной, связанной, общей соляной кислоты и общей кислотности желудочного сока.
- •6.2. Количественное определение аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы в сыворотке крови
- •6.3. Доказательство проявления активности аланин-аминотрансферазы (АлАт) методом бумажной хроматографии
- •6.4. Экспресс-метод определения повышенного содержания фенилаланина в плазме крови
- •6.5. Количественное определение мочевины в моче ферментативным уреазным/фенол-гипохлоритным методом
- •6.6. Количественное определение креатинина в моче
- •6.7. Коллоквиум по теме: «Обмен простых белков» Вопросы, для самостоятельной подготовки
- •Варианты письменной части коллоквиума
- •Правильные ответы
- •Раздел 7: Обмен хромопротеинов и нуклеопротеинов. Биохимия крови и мочи. Биосинтез нуклеиновых кислот и белков. Введение
- •7.1. Определение общего билирубина в сыворотке крови
- •7.2. Количественное определение мочевой кислоты в моче
- •7.3. А. Определение активности -амилазы в моче
- •7.3. Б. Составные части мочи в норме и при патологии
- •7.4. Определение активности холинэстеразы в сыворотке крови
- •7.5. Определение активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови
- •7.6. Коллоквиум по теме: «Обмен хромопротеинов и нуклеопротеинов. Биохимия крови и мочи. Биосинтез нуклеиновых кислот и белка». Вопросы, для самостоятельной подготовки
- •Варианты письменной части коллоквиума
- •Правильные ответы
- •Раздел 8: Подготовка к экзамену
- •8.1. Основные вопросы, выносимые на обсуждение
- •8.2. Пример экзаменационного тестового задания по курсу биохимии
- •59. Найти соответствие между процессом и его графическим изображением
- •60. Цикл мочевинообразования установил
- •Ответы к экзаменационному тесту
- •Раздел 9: Приложения
- •9.1. Термины, различающиеся по смыслу, но сходные по написанию и звучанию
- •9.2. Стандартные биохимические наборы и реактивы, используемые в практикуме
- •9.3. Рекомендуемая литература
- •Содержание
- •Раздел 7: Обмен хромопротеинов и нуклеопротеинов. Биохимия крови и мочи. Биосинтез нуклеиновых кислот и белков. 126
- •Раздел 8: Подготовка к экзамену 148
- •Раздел 9: Приложения 161
6.1. Количественный анализ желудочного сока. Определение свободной, связанной, общей соляной кислоты и общей кислотности желудочного сока.
Желудочный сок представляет собой бесцветную жидкость с сильнокислой реакцией (рН 1,5 – 2,0). За сутки у человека выделяется около 1,5 л желудочного сока; в его состав входят вода, неферментативные белки, ферменты (пепсин, гастриксин), муцин, фактор Касла, соляная кислота, гидрофосфаты и некоторые другие соединения.
Кислая реакция желудочного сока обусловлена присутствием соляной кислоты, гидрофосфатов, а при патологических процессах – молочной кислоты и жирных кислот. Совокупность всех веществ, способных быть донорами протонов, желудочного сока, составляют общую кислотность. Соляную кислоту, связанную с белками и продуктами их переваривания, называют связанной соляной кислотой, а находящуюся в несвязанном виде - свободной соляной кислотой. Содержание последней подвержено значительным колебаниям, тогда как количество связанной соляной кислоты достаточно постоянно.
В характере секреции желудочного сока различают следующие патологические изменения: 1) гиперхлоргидрию – увеличение содержания свободной соляной кислоты и общей кислотности. Такое состояние преимущественно наблюдается при язвенной болезни желудка; 2) гипохлоргидрию – уменьшение количества свободной соляной кислоты и общей кислотности; 3) ахлоргидрию – полное отсутствие соляной кислоты, общая кислотность при этом значительно снижена; 4) ахилию – отсутствие секреции желудочного сока.
Уменьшение или отсутствие соляной кислоты в желудке может наблюдаться при хроническом гастрите, раке желудка, злокачественном малокровии.
В клинике используют рН-метрию желудочного сока, однако полезную информацию можно получить простым, изящным способом, предложенным ниже.
Цель работы
Последовательно оттитровать один из трех образцов желудочного сока раствором NaOH в присутствии двух индикаторов и на основании расчетов сделать вывод о кислотности желудочного сока: нормальная, повышенная или пониженная. Сравнить с другими образцами и отметить характер изменения общей кислотности, а также общей, свободной и связанной соляной кислоты.
Принцип метода
Пользуясь различными индикаторами (диметиламиноазобензол и фенолфталеин) в одной и той же пробе желудочного сока определяют как общую кислотность, так и содержание общей, свободной и связанной соляной кислоты.
Общую кислотность желудочного сока выражают количеством миллилитров 0,1 М раствора NaOH, пошедших на титрование 100 мл желудочного сока в присутствии индикатора фенолфталеина (интервал перехода окраски pH 8,2 – 10). В норме общая кислотность составляет 40-60 титрационных единиц (ед.).
Свободную соляную кислоту выражают количеством миллилитров 0,1 М раствора NaOH, пошедших на титрование 100 мл желудочного сока в присутствии индикатора диметиламиноазобензола (интервал перехода окраски рН 1,0 – 3,0). В норме содержание свободной соляной кислоты составляет 20-40 ед.
Общая соляная кислота составляет сумму свободной и связанной с белками соляной кислоты (последнюю находят по разности между общей и свободной соляной кислотой).
Выполнение работы
В колбу для титрования вносят из бюретки 5 мл исследуемого желудочного сока. Добавляют 1 каплю раствора диметиламиноазобензола и 2 капли раствора фенолфталеина. Образуется розово-малиновое окрашивание. Пробу титруют 0,1 М раствором NaOH до оранжевого окрашивания и отмечают количество миллилитров щелочи, пошедших на титрование свободной соляной кислоты (условно называется I пункт титрования).
Далее титрование продолжают до появления лимонно-желтой окраски и отмечают общее количество миллилитров NaOH, пошедших на титрование от начала общего титрования (II пункт титрования). Затем титрование продолжают до появления малинового окрашивания и отмечают количество миллилитров щелочи, пошедших на титрование вновь от начала общего титрования (III пункт титрования).
Расчеты
Допустим, что на титрование 5 мл желудочного сока до I пункта пошло от 0 до 1,5 мл 0,1 М раствора NaOH, до II от 0 до 2 мл и до III пункта – от 0 до 3 мл. Тогда общая кислотность составит 3 . 100/5 = 60 ед., количество свободной соляной кислоты - 1,5 . 100/5 = 30 ед., количество общей соляной кислоты (среднее арифметическое между II и III пунктом титрования) - (2+3)/2 . 100/5 = 50 ед., а количество связанной соляной кислоты находят по разнице между содержанием общей и свободной соляной кислоты: 50-30 = 20 ед.
Данные титрования и расчета вносят в таблицу (см ниже).
Оформление результатов
Пункт титрования |
NaOH от 0 до соответ-ствующего пункта титрова- ния, мл |
Окраска |
Количество соляной кислоты (ед.) |
Общая кислотность, ед. |
||
свобод-ной |
общей |
связан-ной |
||||
I |
|
|
|
|
|
|
II |
|
|
|
|
|
|
III |
|
|
|
|
|
|
Выводы
Тестовые задания по теме: «Превращение белков и дезаминирование аминокислот»
1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»
Протеиназы, амилазы и липазы относятся к классу гидролаз.
Таурин является продуктом превращения цистеина.
Скатол и индол образуются в кишечнике из аминокислоты тирозина.
Соляная кислота в желудке способствует активации пепсиногена.
При дезаминировании аминокислот в организме образуются биогенные амины.
Пепсин относится к эндопептидазам.
Можно ли заменить НАД+ на НАДФ+ в качестве кофермента глутаматдегидрогеназы?
Происходит ли неокислительное дезаминирование цистеина у человека?
Участвует ли трипсин в активации химотрипсиногена?
Возможно ли самопереваривание пепсина в желудке?
Относятся ли карбркси- и аминопептидазы к эндопептидазам?
Участвует ли уридиндифосфоглюкуроновая кислота в обезвреживании индола?
2) Выбрать один правильный ответ:
Коферментом дезаминирования аминокислот не может быть:
|
Заменимой аминокислотой для человека является:
|
3) Найти соответствие профермента и соответствующего катализатора
1. пепсиноген 2. трипсиноген 3. химотрипсиноген |
А. трипсин Б. этеропептидаза В. НСl |