2.2. Количественное определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови с п-нитрофенилфосфатом

Щелочная фосфатаза содержится в тканях и крови, гидролизует эфиры фосфорной кислоты и в норме поступает в кровь из печени, костной ткани, селезенки, почек, тонкого кишечника и плаценты.

Клинико-диагностическое значение

В клинической практике обычно определяют активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови. Активность возрастает при тяжелом рахите, заболеваниях печени (механическая желтуха, острые гепатиты, циррозы), различных заболеваниях костной системы и снижается при хроническом гломерулонефрите, квашиоркоре, гипотиреозе и цинге.

Цель работы

Определить активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови и сравнить результаты с нормой.

Принцип метода

Щелочная фосфатаза катализирует гидролиз моноэфиров ортофосфорной кислоты. В качестве субстрата используют бесцветный раствор п-нитрофенилфосфата. В результате реакции освобождается п-нитрофенол, окрашенный в щелочной среде в желтый цвет. В качестве буфера используют 1 М раствор диэтаноламина с хлористым магнием (0,5 мМ). Останавливают реакцию 0,5 М раствором NaОН. Скорость образования в результате реакции окрашенного п-нитрофенола пропорциональна активности щелочной фосфатазы. Активность щелочной фосфатазы сильно зависит от субстрата и от буферной системы, в которой проводится анализ. В силу этого недопустимо сравнивать результаты, полученные в различных буферных системах. Соответственно, и нормальные значения активности щелочной фосфатазы при определении в различных буферных системах существенно различаются.

Реакция протекает по уравнению:

Выполение работы (см. приложение)

Реагенты	Опыт	Контроль
5 мМ раствор субстрата п-нитрофенилфосфата в буфере, мл	1,0	1,0
Вода дистиллированная, мл	—	0,05
Выдерживают 5 минут при температуре 37С в термостате
Сыворотка крови, мл	0,05	—
Тщательно перемешивают, замечают время и инкубируют ровно 5 минут при температуре 37С в термостате
Раствор NaOH (0,5 М), мл	1,5	1,5
Фотометрируют против Н2О ( = 405 нм, толщина кюветы 0,5 см). D405
Dоп - Dк

Расчеты

Активность щелочной фосфатазы в Е/л (международные единицы активности, мкмоль^.мин^-1.л^-1) рассчитывают по формуле:

=

где: V₁ – конечный объем пробы, мл

10⁶ – коэффициент пересчета моль в мкмоль

V₂ – объем сыворотки, мл

18,3 10³ –коэффициент молярной экстинкции п-нитрофенола, л^.см^-1.моль^-1

l – толщина кюветы, см

t – время инкубации пробы, мин

Норма: взрослые: при температуре анализа 25С – 40-170 Е/л

при температуре анализа 37С – 70-270 Е/л

У детей определение активности щелочной фосфатазы не имеет диагностического значения.

Выводы

Тестовые задания по теме: «Ферменты»

1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»

1. Специфичность действия сложных ферментов определяется коферментом.

2. Активный центр фермента состоит из субстратсвязывающего и каталитического участков.

3. Скорость ферментативной реакции не зависит от концентрации субстрата.

4. Ферменты ускоряют протекание как прямой, так и обратной реакции.

5. Скорость ферментативной реакции всегда увеличивается с увеличением рН среды.

6. Пепсин обладает абсолютной специфичностью действия.

7. Всегда ли происходит образование фермент-субстратного комплекса в процессе ферментативной реакции?

8. Зависит ли скорость ферментативного процесса от количества присутствующего фермента?

9. Влияют ли ионы тяжелых металлов на активность фермента?

10. Можно ли разделить ферменты методом высаливания сульфатом аммония?

11. Известны ли ферменты, обладающие стереоспецифичностью действия?

12. Связано ли действие некоторых лекарственных препаратов с ингибированием отдельных ферментов?

13. Все ферменты состоят из субъединиц.

14. Константа Михаэлиса выражается в единицах концентрации субстрата.

15. Изоферменты катализируют одну и ту же химическую реакцию.

16. Первая цифра в шифре фермента обозначает, к какому классу он относится.

17. В основе классификации ферментов лежит тип катализируемой реакции.

18. Изоферменты имеют различную электрофоретичекую подвижность.

19. Осуществляют ли лигазы расщепление соединений по двойным связям?

20. Существуют ли мультиферментные комплексы?

21. Изменяется ли константа Михаэлиса в присутствии конкурентного ингибитора?

22. Можно ли измерять скорость ферментативной реакции по изменению свойств молекулы кофермента?

23. Всегда ли ингибирование фермента необратимо?

24. Используют ли препараты очищенных ферментов в терапевтических целях?

Обратимость ферментативной реакции зависит от: температуры ионной силы раствора термодинамического состояния системы концентрации фермента величина рН

К классу оксидоредуктаз не относится фермент: каталаза пероксидаза амилаза аскорбатоксидаза лактатдегидрогеназа

2) Выбрать один правильный ответ

Фермент, не относящийся к гидролазам: амилаза трипсин каталаза холинэстераза пепсин

Конкурентные ингибиторы: повышают КМ фермента понижают КМ фермента повышают Vmax понижают Vmax не изменяют КМ и Vmax

3) Найти соответствие между типом ингибирования ферментативной реакции и его графическим изображением

А. конкурентное

Б. неконкурентное

В. смешанное

Г. бесконкурентное