5.1. Кинетика действия липазы.

Липаза – фермент поджелудочной железы, катализирующий гидролиз сложноэфирных связей в молекуле триацилглицеролов (ТАГ) в тонком кишечнике. Наиболее активно панкреатическая липаза катализирует гидролиз первой и третьей сложноэфирных связей ТАГ с образованием ди- и моноацилглицеролов (ДАГ и МАГ), затем осуществляется гидролиз 2-моноацилглицеролов. В кишечнике могут всасываться только продукты гидролиза ТАГ: глицерин, высшие жирные кислоты, ДАГ и МАГ.

Существенно облегчают процесс переваривания и всасывания липидов желчные кислоты: холевая и хенодезоксихолевая, а также их конъюгаты с глицином и таурином. Сочетание в химической структуре гидрофобной (стероидная часть) и гидрофильной частей придает парным желчным кислотам свойства поверхностно активных веществ (детергентов), которые, образуя микроэмульсию, активируют субстрат липазы и диффузию продуктов липолиза в эпителиальные клетки ворсинок кишечника. При этом фермент и субстрат находятся в разных фазах (несмешивающиеся жидкости) и взаимодействуют только на границе раздела фаз.

Величина поверхности контакта фермента и субстрата определяет скорость гетерогенного катализа: чем больше поверхность, тем выше скорость ферментативной реакции. Детергентное действие желчных кислот приводит к уменьшению силы поверхностного натяжения на границе раздела фаз и крупная капля жира распадается на множество мелких капель, доступных действию фермента.

Дефицит липазы чаще всего связан с заболеваниями поджелудочной железы и сопровождается панкреатической стеатореей (высокое содержание ТАГ в кале без изменения его окраски)

Нарушение экскреторной функции поджелудочной железы при перекрытии её протока (закупорка камнем, воспалительный процесс) при панкреатитах или непосредственном повреждении ткани железы (опухоль, атеросклероз сосудов, кровоизлияние и др.) существенно сказывается на жировом обмене. При стеаторее организм теряет воду и электролиты, затрудняется всасывание жирорастворимых витаминов.

Цель работы

Оценить кинетику действия липазы, определить характер влияния желчи на активность панкреатической липазы.

Принцип метода

В качестве источника нейтрального жира (ТАГ) используют молоко. Действие фермента оценивают по скорости образования кислых продуктов расщепления (свободных ВЖК). Для этого от общего объема смеси жира с липазой через определенные промежутки времени отбирают для титрования равные части. Титрование кислых продуктов гидролиза осуществляют раствором гидроксида натрия (индикатор – фенолфталеин):

R-COOH + NaOH → R-COONa + H₂O

Результаты выражают в миллилитрах пошедшего на титрование раствора щелочи и представляют в виде графика зависимости содержания ВЖК в пробе от времени инкубации пробы.

Выполнение работы

В два стаканчика наливают по 10 мл разбавленного водой (1:1) молока. В один из стаканчиков вносят 1 мл желчи (проба 1), в другой – 1 мл Н₂О (проба 2). Из каждой пробы отбирают в колбу для титрования по 2 мл образовавшейся смеси и титруют 0,01 М раствором NaOH в присутствии фенолфталеина до появления розового окрашивания. Затем в каждую пробу добавляют по 1 мл раствора липазы (вытяжка из поджелудочной железы). Быстро перемешивают струей из пипетки и отмечают время начала реакции. Повторные титрования проводят через каждые 5 минут.

Значение титрования без липазы (время реакции «0») вычитают из величины последующих титрований. В этом случае полученные графики пройдут через начало координат, так как вычитается исходное количество органических кислот, присутствующих в молоке (исходная кислотность молока). Полученные результаты оформляют в виде графика, показывающего динамику отщепления свободных ВЖК во времени под действием липазы в присутствии и в отсутствие желчи.

Пример графика динамики отщепления свободных ВЖК во времени под действием липазы в присутствии (кривая 1) и в отсутствие (кривая 2) желчи.

Схема определения

I. Приготовление исходной смеси (в стаканчиках)
Реактивы и этапы	Проба 1	Проба 2
1. Молоко, разбавленное водой (1:1) 2. Вода 3. Желчь	10 мл - 1 мл	10 мл 1 мл -
II. Определение исходной кислотности молока
	Колба для титрования 1	Колба для титрования 2
1. Исходная смесь (отбирают аликвоту из стаканчика в колбу для титрования) 2. Фенолфталеин (добавляют в каждую колбу) Титруют пробы раствором NaOH (до розового цвета). Значения записывают в таблицу результатов (V0 и V0 ’).	2 мл 1-2 кап	2 мл 1-2 кап
III. Отбор смеси и титрование в присутствии липазы
К оставшейся исходной смеси в оба стаканчика быстро добавляют по 1мл липазы и отмечают время. Через каждые 5 минут отбирают аликвоты в колбы для титрования
	Колба для титрования 1	Колба для титрования 2
1. Аликвота 2. Фенолфталеин Быстро титруют раствором NaOH (до розового цвета). Значения записывают в таблицу результатов (V и V ’) Повторные титрования проводят через каждые 5 минут и результаты заносят в следующую таблицу.	2 мл 1-2 кап	2 мл 1-2 кап

Оформление результатов

t, мин	проба № 1 (с желчью)		проба № 2 (без желчи)
	V(NaOH), мл	V-V0	V’(NaOH),мл	V’-V0 ’
0 (определение исходной кислотности молока)	V0 =	0	V0 ’=	0
5	V =		V’=
10
15
20
		по полученным данным строят кинетическую кривую № 1		по полученным данным строят кинетическую кривую № 2

Выводы

Тестовые задания по теме: «Проверка знаний материала предыдущего семестра»

1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»

1. Смесь свободных аминокислот дает положительную нингидриновую реакцию.

2. Гидрофобность серина выше, чем валина.

3. Специфичность действия ферментов определяется коферментом.

4. Витамины А, В и С относятся к группе водорастворимых витаминов.

5. Все гормоны имеют белковую природу.

6. Глюкокортикоиды стимулируют глюконеогенез.

7. Является ли ТПФ коферментом реакций карбоксилирования?

8. Контролируется ли активность фосфорилазы путем фосфорилирования и дефосфорилирования?

9. Происходит ли разрыв пептидных связей при тепловой денатурации белка?

10. Относится ли тимидин к пуриновым основаниям?

11. Все ли белки имеют четвертичную структуру?

12. Может ли глицерин в печени превращаться в глюкозу?

2) Выбрать один правильный ответ

Белки не могут выполнять функцию: каталитическую транспортную структурную коферментную защитную

При гидролизе лактозы образуются: глюкоза и галактоза манноза и глюкоза галактоза и фруктоза глюкоза и фруктоза две молекулы галактозы

3) Найти соответствие процесса и фермента, участвующего в нём

А. гликолиз Б. ЦТК

1. пируваткиназа 2. цитратсинтаза 3. фосфофруктокиназа 4. α-кетоглутаратдегидрогеназа 5. гексокиназа