14. Введение молекул днк в клетки.

Ответ. Для внесения в клетку вектора есть несколько обозначений в зависимости от того, какой используется вектор и в какие клетки он вносится. Трансформация – это внесение плазмид (и других невирусных векторов) в бактерии, а также клетки растений и грибов. Трансфекция – то же самое, что и трансформация, но только в применении к клеткам животных. Трансдукция – это внесение в любые клетки вирусного вектора. Плазмиды можно выделять из клеток различными методами и вводить в бактерии при помощи трансформации компетентных клеток или сферопластов, электротрансформации, либо в ходе конъюгации (должны иметь tra- или mob-гены). ДЭАЭ-декстрановый метод. Довольно прост и дает высоковоспроизводимые результаты. В 1968 году было показано, что поликатион диэтиламиноэтилдекстран (ДЭАЭ-дестран) значительно увеличивает эффективность включения ДНК в клетки. Эффективность включения зависит от молекулярной массы ДЭАЭ-декстрана. Механизм действия ДЭАЭ-декстрана не установлен. По-видимому, этот поликатион связывается с ДНК и защищает ее от действия нуклеаз. ДЭАЭ-декстран изменяет физические свойства плазматической мембраны и стимулирует пиноцитоз. Недостаток метода – ДЭАЭ-декстран в высоких концентрациях токсичен для клеток. Метод распространения в генотерапии не получил. Кальций-фосфатный метод (Са2+-претипитации). Является модификацией ДЭАЭ-декстранового метода. На монослой клеток КВ, предварительно обработанных ДЭАЭ-декстраном, наносят ДНК аденовируса Аd5 в растворе СаCl2. При этом эффективность трансфекции повышается в 10–100 раз. Аналогичные результаты получаются, когда клетки не обрабатывают ДЭАЭ-декстраном. Поскольку в питательной среде присутствуют фосфаты, при добавлении раствора хлорида кальция образуется осадок фосфата кальция. Удаление этого осадка из среды приводит к потере инфекционности ДНК. Таким образом, трансфекция происходит в результате соосаждения вирусной ДНК и образующихся микрокристаллов фосфата кальция на клеточный монослой. На примере ДНК вируса простого герпеса показано, что сразу после соосаждения с фосфатом кальция вирусная ДНК становится устойчивой к разрушению ультразвуком, но комплекс фосфат кальция – ДНК остается чувствительным к ДНКазе в течение 4 ч. При взаимодействии этого комплекса с культурой клеток животных ДНК становится устойчивой к ДНКазе уже в течение первого часа. ДНК образует с фосфатом кальция прочный комплекс, который при оптимальных условиях поглощают практически все реципиентные клетки. Эффективность поглощения клетками комплекса фосфат кальция – ДНК в значительной степени зависит от рН, при котором формировался этот комплекс, и концентрации ДНК. Важно, чтобы осадок фосфата кальция получился мелкодисперсным. Но даже в оптимальных условиях проведения трансфекции данным методом лишь в 1–5% клеток комплекс достигает ядра. По-видимому, проникновение ДНК из цитоплазмы в ядро является критическим этапом, наиболее сильно влияющим на эффективность трансфекции клеток вирусной ДНК. Кальций-фосфатный метод обычно более эффективен, чем ДЭАЭ-декстрановый, при трансфекции линейными вирусными ДНК и заметно уступает последнему при использовании кольцевых молекул ДНК. Вероятно, образование микрокристаллов фосфата кальция и соосаждение с ними молекул ДНК сопровождается нарушением структуры части этих макромолекул. Особенно данный эффект сказывается на лабильных кольцевых молекулах ДНК, которые после разрыва цепей и перехода в линейную форму уже не инфекционны. ДЭАЭ-декстрановый метод, как более мягкий, обеспечивает значительно большую эффективность проникновения кольцевых молекул ДНК в клетки животных в неповрежденном виде, хотя в целом доля клеток, поглотивших ДНК при обработке ДЭАЭ-декстраном, существенно меньше, чем при трансфекции кальций-фосфатным методом. Метод микроинъекций ДНК. В цитоплазму или прямо в ядро клетки вводят раствор ДНК объемом 10-8 мкл с помощью микрокапилляра; процедура проводится на предметном столике микроскопа с помощью микроманипулятора. Преимущество – можно ввести ДНК прямо в ядро. Недостаток – сложность метода, высока вероятность разрушения ядра либо ДНК. В настоящее время микрокапилляр заменен на микроиглу. Недостаток – можно трансформировать ограниченное число клеток. Сегодня этот метод используется для создания трансгенных животных для введения экзогенной ДНК в ядро. Например, метод дает результаты при введении целевого гена на плазмиде рBR 322 в ядра мышиных клеток. В генотерапии не используется ввиду запрещения работ с половыми клетками человека. Метод прокалывания. Монослой клеток заливается раствором, содержащим плазмидный вектор, и клетки прокалываются микроиглой. Эффективность трансформации 25%. «Генное ружье». Этот метод применяется in vitro и in vivo для введения генов в клетки мышечных тканей. Например, для введения ДНК в мышечную ткань при мышечной дистрофии Дюшена. Генная пушка доставляет частицы тяжелых металлов, покрытые плазмидной ДНК. Размеры частиц золота – 1–3 мкм. Недостатком этих методов является нестабильность вводимой ДНК в клетках и низкая эффективность встраивания генов в геном. Методика не применима в случае быстрорастущих клеток и требует многократного инъецирования. Не все типы тканей пригодны для введения ДНК этим способом. Недостаток: низкий уровень экспрессии трансгена. Упаковка в липосомы используется для защиты экзогенного генетического материала от разрушающего действия рестриктаз. Липосомы – сферические оболочки, состоящие из фосфолипидов. Получают их путем резкого встряхивания смеси водного раствора и липидов, либо обрабатывая ультразвуком водные эмульсии фосфолипидов. Липосомы, состоящие из фосфатидилсерина и холестерина наиболее пригодны для введения ДНК в клетки животных и растений. Для эукариотических клеток трансфекция производится эффективнее с применением катионных липосом, потому что клетки к ним более чувствительны. Процесс имеет своё название – липофекция. Этот метод сегодня считается одним из самых безопасных. Липосомы нетоксичны и неиммуногенны. Однако, эффективность переноса генов с помощью липосом ограничена, поскольку внесенная ими ДНК в клетках обычно сразу же захватывается лизосомами и разрушается. Введение ДНК в клетки человека с помощью липосом сегодня является главным при терапии in vivo. Метод прямого переноса плазмид из бактерий в клетки животных. Перспективным подходом к введению плазмидных ДНК в клетки млекопитающих стал разработанный В. Шаффнером в 1980 г. метод прямого переноса плазмид из бактерий в клетки животных. Метод основан на слиянии сферопластов клеток Е. Colli с клетками животных. Для этого сферопласты осаждают на монослой клеток в искусственном поле тяжести (центрифугирование) при добавлении полиэтиленгликоля, который снижает отрицательный заряд на поверхности сферопластов и клеток и тем самым облегчает их слияние. Бактериальные клетки предварительно инкубируют с ингибитором белкового синтеза – хлорамфениколом. В этих условиях плазмиды с ослабленным контролем репликации амплифицируются и их копийность достигает нескольких тысяч на клетку. Повышенная копийность плазмиды обеспечивает высокую частоту ее проникновения в клетки животных. Другим достоинством данного метода является то, что для введения плазмид в клетки животных отпадает необходимость в наработке и очистке плазмидной ДНК. Электропорация – очень популярный метод; мгновенное повышение проницаемости мембраны достигается за счет того, что клетки подвергаются коротким воздействиям интенсивного электрического поля (2–2.5 кВ/см, в течение 1 мс, в присутствии катионов Ca и Mg). Показано, что в оптимальных условиях количество трансформантов может достигать 80% выживших клеток. На человеке на сегодняшний день не используется. Электропорация основана на том, что импульсы высокого напряжения обратимо увеличивают проницаемость биомембран. В среду для электропорации добавляют клетки и фрагменты ДНК, которые необходимо ввести в клетки. Через среду пропускают высоковольтные импульсы (напряжение 200–350 В, длительность импульса 54 мс), приводящие к образованию пор (электропробой) в цитоплазматической мембране, время существования и размер которых достаточны, чтобы такие макромолекулы, как ДНК, могли из внешней среды войти в клетку в результате действия осмотических сил. При этом объем клетки увеличивается. Напряженность электрического поля и продолжительность его действия, концентрации трансформирующей ДНК и реципиентных клеток для каждой системы клеток подбирают экспериментально, с тем чтобы достичь высокого процента поглощения ДНК выжившими клетками. Показано, что в оптимальных условиях электропорации количество трансформантов может достигать 80% выживших клеток. Электропорация – физический, а не биохимический метод, и это, по-видимому, обусловливает его широкое применение. Многочисленные исследования продемонстрировали, что электропорация может успешно использоваться для введения молекул ДНК в разные типы клеток, такие как культивируемые клетки животных, простейшие, дрожжи, бактерии и протопласты растений. Электропорирующий эффект высоковольтного разряда на бислойную липидную мембрану, по-видимому, зависит от радиуса ее кривизны. Поэтому мелкие бактериальные клетки эффективно поглощают ДНК при значительно большей напряженности (10 кВ/см и более), чем крупные животные и растительные клетки, эффективно поглощающие ДНК при напряженности поля 1–2 кВ/см. Электропорация – наиболее простой, эффективный и воспроизводимый метод введения молекул ДНК в клетки. Однако до недавнего времени этот метод использовался в ограниченном числе лабораторий в связи с отсутствием серийных приборов — электропораторов. Появление и совершенствование таких приборов в ближайшие годы приведет к широкому применению данного подхода в генетической инженерии самых разных типов клеток.