8. Способы объединения фрагментов днк. Днк-лигазы. Днк-полимераза

Ответ. ДНК-лигаза катализирует синтез фосфодиэфирной связи в 2-х цепочечной молекуле нуклеиновой кислоты. ДНК-лигазы сшивают рядом расположенные нуклеотиды, образуя связь между остатками сахаров. ДНК-лигазы абсолютно необходимы в процессах репарации ДНК, в процессах репликации – при удвоении цепи ДНК. НАД-зависимая ДНК-лигазы Tfi из термофильной бактерии Thermus filiformis – первая ДНК-лигаза, для которой методом рентгеноструктурного анализа установлена 3-мерная структура. Этот фермент, как и все ДНК-лигазы, имеет модульную организацию и состоит из 4 основных доменов. Он имеет длину 667 аминокислотных остатков (мол. м. 75,9 кД).Самым большим является N-концевой домен 1, состоящий из двух субдоменов. На самом конце находится субдомен 1а длиной 73 остатка, являющийся сайтом связывания кофактора НАД+. Субдомен 1b (остатки 73–317) образован 3 антипараллельными b-слоями и несколькими фланговыми a-спиралями и является доменом аденилирования. Субдомен 1b содержит остаток лиз116 активного центра, подвергающийся аденилированию. Следующий домен 2 является доменом связывания олигонуклеотидов, т. к. он имеет укладку связывания олигомеров ОВ, похожую на укладку взаимодействия с онДНК у связывающих он ДНК белков. Домены 1 и 2 содержат все 5 консервативных мотивов нуклеотидилтрансфераз и вместе образуют минимальный домен ДНК-лигазы, достаточный для каталитической активности, т. к. в их пределах расположены все каталитически существенные аминокислотные остатки и остатки, необходимые для специфического связывания ДНК-лигазы с ОР ДНК. Домены 1 и 2 физически взаимодействуют друг с другом, что вызывает значительное повышение аденилирующей активности домена 1. Для такого взаимодействия необходимо сильное изменение конформации белка со смещением С-концевой части домена 2 в сторону домена 1.Домен 3 (остатки 403–581) является вторым «некаталитическим» контактным участком, обеспечивающим связывание ДНК-лигазы с ДНК. Он образован 2 сегментами белка. Область остатков 403–429 содежит 4 консервативных остатка цистеина, образующих цинковый палец типа Сys4, а смежная область остатков 429–581 включает 4 копии мотива спираль-шпилькаспираль. Обе структуры часто используются белками для взаимодействия с ДНК. На самом С-конце ДНК-лигазы Tfi расположен необычный домен 4, или BRCT, гомологичный C-концевому домену эукариотического белка BRCA1, ассоциированного с раком молочной железы. Он состоит из 4-нитевого параллельного b-слоя и трех a-спиралей и имеется у очень многих лигаз. Домен 4 очень подвижен в так называемой «открытой» конформации ДНК-лигазы и сближен с N-концевым доменом 1а в «закрытой» конформации, в которой лигаза принимает тороидальную форму. Предполагается, что домен 4 играет в лигазе роль ворот, регулирующих связывание и освобождение днДНК. Подобно белку PCNA, в закрытой конформации ДНК-лигаза может образовывать скользящий зажим на ДНК и двигаться по ДНК до тех пор, пока она не встретит ОР. Аналогичную доменную структуру имеет ДНК-лигаза LigA E. coli, а в лигазе LigB отсутствуют два остатка цистеина цинкового пальца и весь С-концевой домен BRCT. Известная 3-мерная структура ДНК-лигазы Tfi позволила предложить следующую гипотетическую схему, которая, вероятно, является общей для многих типов ДНК-лигаз. В исходном состоянии (А) лигаза находится в закрытом неактивном состоянии и неспособна связываться с ДНК. Аденилирование под действием НАД+ или АМФ (стадия I) переводит лигазу в открытое активированное состояние (В), в котором она неспецифически связывается с днДНК, вновь переходит в закрытое состояние С (стадия II) и транслоцируется по днДНК до тех пор, пока не встретит ОР в одной из нитей. Узнавание ОР в ДНК (стадия III) сопровождается изгибанием ДНК и изменением конформации белка на контактной поверхности между доменами 1 и 2. В результате 5’- и 3’-концы ОР оказываются в щели между этими доменами и сближаются с аденилированным остатком лиз116. Это обеспечивает деаденилирование белка и перенос АМФ на 5’-конец разорванной нити (стадия IV). В этом состоянии лигаза связывает катионы Mg2+, необходимые для атаки 3’-гидроксильной группы нити ДНК на активированный АМФ 5’-конец онДНК (стадия V). В результате происходит воссоединение ОР, освобождение неорганического фосфата pi и изменение конформации лигазы с переходом в открытую форму (F). Лигированная ДНК освобождается от ДНК-лигазы, которая возвращается в исходное неактивное закрытое состояние А (стадия VI). Для активности ДНК-лигаз необходимы нуклеотидные кофакторы, в зависимости от природы которых лигазы можно разбить на два класса. ДНК-лигазы эукариотов, археев, бактериофагов, эукариотических вирусов и некоторых эубактерий используют в качестве кофакторов АТФ и относятся к классу I. ДНК-лигазы класса II, кофактором которых служит НАД+, имеются исключительно у эубактерий. ДНК-лигазы LigA и LigB у E.coli принадлежат к этому классу. Лигаза фага Т4 (АТФ в присутствии Mg2+) более универсальна, так как помимо лигирования липких концов способна катализировать реакцию воссоединения двухцепочечных фрагментов ДНК с тупыми концами. Она используется чаще. Нуклеотиды хоть и разные, но механизм реакции с АТФ и НАД получается одинаковый, отличие оказывается только в уходящей группе (никотинамидфосфат или аденозиндифосфат). Таким образом сшиваются все разрывы между фрагментами Оказаки, которые образовались. ДНК-полимераза удаляет затравку, застраивает полученную «брешь», а полученный однонитевой разрыв, который она оставляет, в силу специфики ее ферментных активностей, зашивается ДНК-лигазой. Для связывания ДНК-лигаз с ОР в днДНК абсолютно необходима 5’-фосфатная группа, а 3’-ОН-группа не обязательна. Однако обе группы требуются для реакции лигирования. ДНК-лигазы воссоединяют в ДНК только ОР, но не бреши, и пробел длиной даже в 1 н. полностью устраняет связывание фермента с ДНК. ДНК-лигазы участвуют в воссоединении фрагментов Оказаки, образующихся во время синтеза отстающей нити в процессе репликации. Кроме того, ДНК-лигазы устраняют ОР ДНК в процессах репарации и рекомбинации. У млекопитающих идентифицированы 4 разных типа ДНК-лигаз, содержащихся в ядерных экстрактах клеток. Главной функцией ДНК-лигазы I явлется воссоединение фрагментов Оказаки, хотя она участвует и в репарации ДНК. ДНК-лигаза I человека имеет длину 919 остатков (мол. м. 102 кД) и кодируется геном LIG1, расположенным в хромосоме 19 и содержащим 27 интронов. ДНК-лигазы III, участвующая в эксцизионной репарации ДНК, и III’, (известная также как ДНК-лигаза II) кодируются альтернативно сплайсированными мРНК одного и того же гена, и их аминокислотные последовательности различаются только на С-конце. ДНК-лигаза IV по субстратной специфичности отличается от ДНК-лигаз I и III и у мышей является существенным белком. Она участвует в негомоогическом соединении концов ДНК во время репарации двунитевых разрывов ДНК. У дрожжей S. cerevisiae отсутствуют гомологи ДНК-лизаз III млекопитающих, а гомолог ДНК-лигазы IV кодируется геном DNL4/LIG4 и также участвует в негомологическом соединении концов ДНК. Главная ДНК-лигаза I у дрожжей кодируется ядерным геном CDC9. Продуктами этого гена являются два белка, которые транслируются в одной рамке считывания, но с использованием разных инициирующих кодонов. При инициации трансляции на первом кодоне АУГ образуется белок длиной 755 остатков, имеющий на N-конце функциональную предпоследовательность, которая нацеливает белок на экспорт в митохондрии. При инициации трансляции на втором кодоне АУГ образуется белок длиной 732 остатка, локализующийся в ядре. После отщепления пропоследовательности в митохондриях первая форма ДНК-лигазы I становится тождественной главной ядерной форме.

9. ДНК-зависимые ДНК-полимеразы.

Ответ. ДНК-полимеразы – фермент, участвующий в репликации, способен синтезировать новые цепи ДНК с матричной цепи. Ферменты этого класса катализируют полимеризацию дезоксирибонуклеотидов вдоль цепочки ДНК, фермент «считывает» и использует в качестве шаблона. Новый тип нуклеотида определяется по принципу комплементарности к матрице, с которой ведется считывания. Молекула ДНК, синтезируется, является комплементарной к матричной цепи и идентична с одним из цепей второй двойной спирали. Полимераза позволяет химическим соединениям отдельных молекул (мономеров) образовывать цепь (полимер). В случае ДНК-полимеразы образующийся полимер представляет собой дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК). Мономеры представляют собой дезоксирибонуклеотиды, точнее дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP). ДНК-зависимая ДНК-полимераза всегда использует уже существующую одиночную цепь ДНК в качестве матрицы для синтеза новой комплементарной цепи, нуклеотидная последовательность которой, таким образом, определяется шаблоном. Это сохранение последовательности ДНК имеет решающее значение для способности ДНК-полимеразы копировать генетическую информацию, закодированную в ДНК. Правильное копирование матрицы достигается путем комплементарного спаривания включенных нуклеотидных оснований с основаниями матрицы ДНК, опосредованного водородными связями. Синтез новой цепи ДНК происходит от 5‘ до 3′ конца. Химически происходит нуклеофильная атака концевой 3’-гидроксильной группы цепи ДНК на α-фосфат dNTP с высвобождением пирофосфата. Этот этап катализируется полимеразой. В отличие от РНК-полимераз (производит РНК, которая используется для синтеза белков из аминокислот), синтез комплементарной цепи ДНК в ДНК-полимеразах может происходить только в том случае, если для полимеразы доступен свободный 3′-гидрокси-конец. Затем к этому концу присоединяется первый нуклеотид. В полимеразной цепной реакции (ПЦР) однониточная ДНК (праймер) длиной около 15–20 нуклеотидов используется в качестве начальной точки реакции. Для ферментов обычно требуются ионы магния в качестве кофактора. Катализ образования диэфирной связи функционально аналогичен соответствующей реакции РНК-полимераз. Последний нуклеотид уже синтезированного участка и нуклеотид, который должен быть добавлен, координируются с одним из двух ионов магния, каждый в каталитическом центре полимеразного домена. Первая фосфатная группа добавляемого нуклеотида координируется с обоими ионами магния. Пространственное положение позволяет гидроксигруппе предыдущего нуклеотида атаковать фосфатную группу добавляемого нуклеотида. При этом отщепляется пирофосфатный остаток. Процессы в активных центрах ДНК-полимеразы, где катализируются реакции нуклеиновых кислот. Многие полимеразы также выполняют другие функции ферментов. В присутствии низких концентраций дНТФ преобладает 3‘→5’ экзонуклеазная активность по удалению нуклеотидов. Некоторые полимеразы также обладают экзонуклеазной активностью 5‘→3’. Чтобы гарантировать отсутствие ошибок при чтении матрицы ДНК, они имеют эту функцию корректирующего считывания, т.е. они могут обнаружить вставку неподходящего нуклеотида, а затем удалить его из ДНК с помощью экзонуклеазной активности. Это делает возможным деградацию существующей цепи ДНК или РНК, которая уже спарена с цепью матрицы, пока формируется новая цепь. Это приводит к замене старой пряди на новую. Эта экзонуклеазная активность используется методом ник-трансляции. Было обнаружено три класса полимераз у прокариот (I, II, III) и полимеразы α, β, γ, δ, ε у эукариот.

У млекопитающих встречается только пять типов: α, β, γ, δ и ε. Предполагается, что полимеразы δ и ε, которые имеют решающее значение для репликации, характеризуются высокой вычислительной мощностью и функцией контрольного считывания. Напротив, полимеразы α и β демонстрируют только низкую вычислительную мощность и не имеют функции контрольного считывания. У бактерий, таких как Escherichia coli, есть три различных ДНК-зависимых ДНК-полимеразы. Одна из них, ДНК-полимераза I (PolI), была выделена в 1955. Однако это не самая важная полимераза для репликации в E. coli, так как она катализирует всего около 20 стадий синтеза (то есть имеет только низкую вычислительную мощность). Однако он отвечает за деградацию праймера во время репликации из-за своей 5‘→3’ экзонуклеазной активности. ДНК-полимераза II и ДНК-полимераза III, две другие ДНК-полимеразы в E. coli, были выделены только через 15 лет после открытия ДНК-полимеразы I, после того, как мутанты E. coli с дефектом в гене полимеразы I, тем не менее, оказались компетентными для репликация. Однако эти мутанты были особенно чувствительны к УФ-излучению и алкилирующим веществам, поэтому предполагается, что ДНК-полимераза I в основном выполняет задачи репарации. Полимераза III, которая осуществляет фактическую репликацию в E. coli, состоит всего из семи субъединиц и встречается лишь в очень небольшом количестве копий на бактериальную клетку. Единственная известная независимая ДНК-полимераза – это терминальная дезоксирибонуклеотидилтрансфераза. У архебактерий есть термостабильные типы, которые также используются для ПЦР. ДНК-полимеразы имеют центральное значение для репликации ДНК. Они позволяют точно копировать генетическую информацию в форме ДНК, что является решающим шагом в воспроизводстве и воспроизведении живых организмов. Ферменты также играют важную роль в процессах, связанных с репарацией ДНК. В лаборатории ДНК-полимеразы часто используются для полимеразной цепной реакции и связанных методов (например, RT-PCR, qPCR), для ник-трансляции, случайного праймирования и секвенирования ДНК. Большое количество различных термостабильных типов (например, полимераза Taq из Thermus aquaticus), некоторые из которых модифицированы с помощью белковой инженерии. Помимо высокой температурной стабильности, термостабильные ДНК-полимеразы архаичного происхождения, такие как полимераза Pfu, обеспечивают надежное считывание, поскольку ПЦР не должна приводить к каким-либо изменениям в продуцируемой ДНК.

10. ДНК-зависимые РНК-полимеразы.

Ответ. Существует два основных типа РНК-полимераз – односубъединичные и многосубъединичные. Односубъединичные РНК-полимеразы участвуют в транскрипции геномов некоторых бактериофагов, а так же митохондрий. Многосубъединичные РНК-полимеразы (РНКП) отвечают за транскрипцию большинства генов в клетках всех живых организмов. Структура РНКП и общий механизм синтеза РНК высококонсервативны и в основных чертах очень сходны у бактерий, архей и эукариот. У эукариот имеется несколько различных РНКП, между которыми разделяются функции синтеза мРНК, тРНК и рРНК. В клетках прокариот имеется только одна РНКП, которая синтезирует все типы РНК в клетке. Известны две формы РНКП: кор- и холофермент. Кор-фермент имеет относительную молекулярную массу около 400 кДа и состоит из пяти субъединиц: двух α, β, β′и ω. Гомологичные субъединицы входят в состав всех известных многосубъединичных РНКП. Холофермент состоит из кор-фермента и σ-субъединицы. Транскрипционный цикл, осуществляемый РНК-полимеразой, включает в себя 3 последовательные стадии – инициацию, элонгацию и терминацию синтеза РНК. Кор-фермент РНКП обладает каталитической активностью, но не способен к инициации транскрипции. Для узнавания специфических последовательностей ДНК (промоторов) необходимо присоединение фактора инициации – σ-субъединицы, – и образование холофермента РНКП. σ-субъединица играет центральную роль в узнавании промоторов, плавлении ДНК и последующем уходе РНКП с промотора. По своей структуре кор-фермент РНКП напоминает клешню краба, одна половина которой образована в основном β′-, а вторая – β-субъединицей; между ними находится главный канал РНКП, в котором происходит связывание ДНК и РНК в процессе транскрипции. Димер α-субъединиц располагается со стороны, противоположной главному каналу; ω-субъединица контактирует с β′-субъединицей на внешней стороне РНКП. Активный центр фермента образован β′- и β-субъединицами и располагается в глубине главного канала. Сбоку от главного канала расположен вторичный канал, который соединяется с главным в области активного центра. Вторичный канал служит местом связывания многих регуляторных факторов, и основным путем поступления нуклеотидов в активный центр РНКП.

11. РНК-зависимая ДНК-полимераза.

Ответ. РНК-зависимая ДНК-полимераза (ревертаза или обратная транскриптаза (ОT)) представляет собой фермент, используемый для создания комплементарной ДНК (кДНК) из РНК матрицы, процесс называется обратной транскрипцией. Обратные транскриптазы используются некоторыми вирусами, такими как ВИЧ и вирус гепатита В, для репликации своих геномов, мобильными генетическими элементами ретротранспозона для пролиферации в геноме хозяина и эукариотическими клетками для удлинения теломер на концах их линейных хромосом. Вопреки широко распространенному мнению, этот процесс не нарушает потоки генетической информации, описанные в классической центральной догме, поскольку передача информации от РНК к ДНК явно считается возможной. Ретровирусная ОТ имеет три последовательных биохимических активности: активность РНК-зависимой ДНК-полимеразы, активность рибонуклеазы H (РНКаза H) и активность ДНК-зависимой ДНК-полимеразы. В совокупности эти активности позволяют ферменту превращать одноцепочечную РНК в двухцепочечную кДНК. В ретровирусах и ретротранспозонах эта кДНК может затем интегрироваться в геном хозяина, из которого могут быть созданы новые копии РНК посредством транскрипции клетки-хозяина. Та же последовательность реакций широко используется в лаборатории для преобразования РНК в ДНК для использования в молекулярном клонировании, секвенировании РНК, полимеразной цепной реакции (ПЦР) или анализе генома. Наиболее детально изучена ревертаза ретровирусов птиц. Каждый вирион содержит около 50 молекул этого фермента. Обратная транскриптаза состоит из двух субъединиц — a (65 кДа) и b (95 кДа), присутствующих в эквимолярном количестве. Обратная транскриптаза обладает, по крайней мере, тремя ферментативными активностями: ДНК-полимеразной, использующей в качестве матрицы как РНК, так и ДНК; активностью РНКазы Н, гидролизующей РНК в составе гибрида РНК–ДНК, но не одно- или двухцепочечную РНК; ДНК-эндонуклеазной активностью. Первые две активности необходимы для синтеза вирусной ДНК, а эндонуклеаза, по-видимому, важна для интеграции вирусной ДНК в геном клетки-хозяина. Очищенная обратная транскриптаза синтезирует ДНК как на РНК-, так и на ДНК-матрицах. Чтобы начать синтез, ревертазе, как и другим полимеразам, необходим короткий двухцепочечный участок (праймер). Праймером может служить одноцепочечный сегмент как РНК, так и ДНК, которые в процессе реакции оказываются ковалентно связанными с новосинтезированной цепью ДНК. Обратную транскриптазу преимущественно используют для транскрипции матричной РНК в комплементарную ДНК (кДНК). Реакцию обратной транскрипции проводят в специально подобранных условиях с использованием сильных ингибиторов РНКазной активности. При этом удается получать полноразмерные ДНК-копии целевых молекул РНК. В качестве праймера при обратной транскрипции поли (А)-содержащих мРНК используют олигo (dT), а для молекул РНК, не имеющих З'-поли (А) концов, – химически синтезированные олигонуклеотиды, комплементарные З'-концу изучаемой РНК. После синтеза на мРНК комплементарной цепи ДНК и разрушения РНК (обычно применяют обработку щелочью) осуществляют синтез второй цепи ДНК. При этом используют способность ревертазы образовывать на 3'-концах одноцепочечных кДНК самокомплементарные шпильки, которые могут выполнять функции праймера. Матрицей служит первая цепь кДНК. Данная реакция может катализироваться как ревертазой, так и ДНК-полимеразой I E. coli. Показано, что сочетание этих двух ферментов позволяет повысить выход полноценных двухцепочечных молекул кДНК. По окончании синтеза первая и вторая цепи кДНК остаются ковалентно связанными петлей шпильки, служившей праймером при синтезе второй цепи. Эту петлю расщепляют эндонуклеазой S1, специфически разрушающей одноцепочечные участки нуклеиновых кислот. Образующиеся при этом концы не всегда оказываются тупыми, и для повышения эффективности последующего клонирования их репарируют до тупых с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E. coli. Полученную двухцепочечную кДНК можно затем встраивать в клонирующие векторы, размножать в составе гибридных молекул ДНК и использовать для дальнейших исследований. Чтобы начать синтез, ревертазе, как и другим полимеразам, необходим короткий двухцепочечный участок (праймер). Праймером может служить одноцепочечный сегмент как РНК, так и ДНК, которые в процессе реакции оказываются ковалентно связанными с новосинтезированной цепью ДНК. В генетической инженерии используют как олиго-(дТ) праймеры, комплементарные 3'-полиА концам мРНК, так и набор “случайных” по составу и последовательности гексануклеотидов (random primers). Часто для молекул РНК с известной первичной последовательностью, не имеющих З'-поли (А) концов, используют химически синтезированные олигонуклеотиды, комплементарные З'-концу. Эндогенные ретровирусы относятся к большому классу мобильных элементов генома – к ретроэлементам. Эти мобильные элементы используют для своих перемещений механизм, на который указывает приставка «ретро» в названии элемента – она означает «движение вспять, в обратном направлении». До открытия в 1970 году двумя нобелевскими лауреатами, американскими учеными Говардом Темином и Дэвидом Балтимором обратной транскрипциисчиталось, что движение в направлении от РНК к ДНК невозможно. Но, как оказалось, этот генетический метод активно используется в живой природе, в том числе и такими опасными ее представителями, как вирусы (среди которых и самый опасный для человека – ВИЧ). Вирус прикрепляется к строго определенным клеткам хозяина благодаря образованию связей белков капсида и рецепторов на поверхности клетки. После проникновения в клетку собственные ферменты или ферменты клетки хозяина разбирают капсид. Вирусная РНК высвобождается и подвергается обратной транскрипции: обратная транскриптаза формирует по матрице РНК цепочки ДНК, а интеграза инициирует проникновение провирусной ДНК в ядро и включение ее в геном хозяина. В ядре происходит процесс репликации (повторной сборки) вирусной РНК, который уже стал неотъемлемой функцией генома хозяина. В хозяйской цитоплазме вирусная РНК обзаводится капсидом. Отпочковываясь от клетки, обновленный вирус прихватывает с собой часть мембраны хозяина, используя ее в качестве собственной оболочки.