36. Нитевидные фаги в качестве клонирующих векторов.

Ответ. При клонировании и амплификации в векторных плазмидах или производных фага лямбда чужеродные фрагменты ДНК находятся в двухцепочечной форме. Однако в ряде случаев (при определении последовательностей нуклеотидов, выделении комплементарной РНК, направленном мутагенезе и т.д.) необходимо манипулировать с одной цепью ДНК. Нитевидные фаги Е. соlі – М13 наиболее подходят для этой цели. Фаг М13 – нитевидный колифаг, имеющий кольцевой ДНК-геном. Для получения рекомбинантных ДНК используют репликативную форму фага, представляющую собой кольцевую двухнитевую ДНК размером 6400 п.н., в которую вставлен ген lacZ, содержащий полилинкер сайтов для целого ряда рестриктаз. ДНК упакована в трубочку, состоящую из 2700 копий основного оболочечного белка рVIII и закрытую на концах четырьмя или пятью молекулами каждого из четырех минорных оболочечных белков рIII, рVI, рVІІ и рІХ. Рекомбинантные фаги отбирают из зон лизиса бактериального газона, имеющих белый цвет. Нитевидные фаги адсорбируются на F-пилях Е. соІі и поэтому способны инфицировать лишь мужские (F+) бактериальные клетки. Инфекция клеток Е. соІі начинается после адсорбции белка рIII, входящего в состав фаговых частиц, на конце F-пили хозяйской клетки. После этого одноцепочечная ДНК фага, называемая (+) цепью – переносится в цитоплазму клетки. Бактериальные полимеразы осуществляют синтез второй (–) цепи, образуя двухцепочечную репликативную форму фагового генома. Синтез второй цепи инициируется на оrі (–), расположенном в межгенной области ІR. На молекулах репликативной формы осуществляется транскрипция и последующая трансляция фаговых генов. Белок рІІ вносит разрыв в (+) цепь репликативной формы в участке ori (+), также расположенном в межгенной области ІR. Это приводит к репликации фаговой ДНК по модели катящегося кольца с высвобождением (+)-цепи. По завершении цикла белок рІІ лигирует концы образовавшейся одноцепочечной (+) ДНК. На ранних этапах инфекции новые (+)-цепи служат в качестве матриц для образования дополнительных молекул репликативной формы, однако по мере накопления фагового белка рV, связывающего ДНК, процесс формирования репликативной формы тормозится. Копийность репликативной формы составляет 200–300 молекул на клетку. Для сборки вирионов и их экспорта необходимы клеточные мембраны. Вновь синтезированные оболочечные белки фага встраиваются в плазматическую мембрану. Белки рІІІ и рVIII синтезируются с М-концевыми сигнальными пептидами, которые отщепляются после секреции через плазматическую мембрану С-концевые гидрофобные домены белков остаются в мембране, а N-концевые части выходят в периплазматическое пространство. Белки рІ и рІV образуют мультимерный экспортный канал между внутренней и внешней мембранами. Инициация сборки и экспорта вириона происходит после взаимодействия специфической нуклеотидной последовательности (так называемый сигнал упаковки) в ІR-области (+) ДНК с комплексом рІ-рIV, бактериальным тиоредоксином и минорными оболочечными белками рVII и рІХ. Образуемые вирионы экскретируются через экспортный канал, при этом молекулы белка рV на ДНК постепенно замещаются молекулами белка pVІІІ. Присоединение белков рVІ и рІІІ к концу формируемых вирионов завершает процесс их сборки. Весьма важным свойством этих фагов явилось то, что они не вызывали лизиса бактерий, а только задерживали их рост, в результате чего на бактериальном газоне формировались светлые зоны фаговых бляшек. Длина вирионов зависит от величины фагового генома и может варьировать в широких пределах. Длина частиц гибридного фага увеличивается пропорционально размеру пакующейся ДНК. Образующиеся при инфекции фаговые частицы постоянно экскретируются клетками без лизиса последних, и этот процесс является энергозависимым. За одну генерацию образуется несколько сотен фагов на клетку. Скорость роста клеток E. coli, зараженных нитевидным фагом, на 25–50% ниже, чем неинфицированных. Поэтому при титровании на твердой агаризованной среде нитевидные фаги образуют на бактериальном газоне мутные бляшки. При размножении данных фагов их геном в бактериальной клетке одновременно присутствует в виде большого числа копий двухцепочечной кольцевой плазмиды и одноцепочечной ДНК в составе вирионов. На одноцепочечной вирионной ДНК обычные генно-инженерные эксперименты невыполнимы. Однако их с успехом можно осуществить на репликативной форме генома нитевидных фагов. Все это обусловило использование данных фагов для создания клонирующих векторов.