29. Векторы на основе репликонов бактериальной плазмиды puc18, puc19.

Ответ. Плазмиды pUC18 и pUC19 представляют собой чрезвычайно удобные для клонирования векторы. Основное их преимущество – наличие полилинкера, включающего 13 уникальных сайтов рестрикции внутри α-фрагмента гена β-галактозидазы, что значительно облегчает селекцию рекомбинантных клонов, которые могут быть отобраны на чашках с IPTG и X-gal как бесцветные колонии на фонеокрашенных нерекомбинантных. Плазмида PUC18 представляет собой кольцевую молекулу ДНК, состоящую из нескольких сотен или тысяч пар оснований. Естественно встречающиеся плазмиды являются вирусами бактерий. Искусственная плазмида pUC18 была генетически сконструирована так, чтобы включать ген устойчивости к антибиотикам к ампициллину (ampR) и ген (и его промотор) для фермента бета-галактозидазы (lacZ). Ген lacZ содержит полилинкерную область, с рядом уникальных сайтов рестрикции, больше нигде не найденных в плазмиде. Соприкосновение с любой из этих эндонуклеаз приведет к одному «разрезу», который линеаризует круговую плазмидную ДНК и позволит ему рекомбинировать с чужеродной ДНК, которая была разрезана той же эндонуклеазой. Плазмида pUC19 имеет длину 2686 п. н. и содержит: ген устойчивости к ампициллину; регулируемый сегмент гена β-галактозидазы (lacZ') лактозного оперона E.coli, ген lacI, кодирующий репрессор, который контролирует экспрессию гена lacZ'; полилинкер — короткую последовательность с множеством уникальных сайтов узнавания для эндонуклеаз (EcoRI, SacI, КрпI, HindIII и др.); точку начала репликации плазмиды ColE1. Присутствие в плазмиде pUC19 гена, обеспечивающего устойчивость к ампициллину, позволяет отбирать клоны E.coli, содержащие данный вектор или рекомбинантные ДНК на его основе на питательных средах с этим антибиотиком. Такие модульные элементы структуры рассматриваемого вектора как lacZ', lacI и MCS дают возможность ускорить и интенсифицировать процедуру селекции клонов с рекомбинантными ДНК. Если клетки, содержащие немодифицированную плазмиду pUC19, выращивать в присутствии изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ), который является индуктором lac-оперона, то продукт гена lacI, так называемый репрессор, не сможет связаться с промоторно-операторной областью гена lacZ', и как следствие будут происходить транскрипция и трансляция плазмидного фрагмента гена lacZ'. Продукт этого фрагмента свяжется с белком, кодируемым хромосомной ДНК (α-комплементация), и в результате образуется активная ß-галактозидаза. Последовательность с множеством сайтов рестрикции (полилинкер) встроена в ген lacZ' так, что она не влияет на продукцию функциональной β-галактозидазы, и если в среде присутствует ее субстрат 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид (XGal), то он будет гидролизоваться под действием этого фермента с образованием продукта синего цвета, окрашивающего колонии клеток, содержащих немодифицированную, т.е. без вставки чужеродной ДНК, плазмиду pUC19. Последовательность процедур клонирования ДНК в векторе pUC19. Донорную ДНК обрабатывают одной из эндонуклеаз рестрикции, для которой имеется сайт в полилинкере. Векторную ДНК pUC19 обрабатывают тем же ферментом. Лигирование линеаризованного вектора и вставки с помощью ДНК-лигазы Т4. После процедуры лигирования инкубационной смесью проводят трансформацию клеток, способных к α-комплементации, которые могут синтезировать ту часть ß-галактозидазы (LacZα), которая соединяется с продуктом гена lacZ' с образованием активного фермента. Обработанные клетки высевают на питательную среду с ампициллином, ИПТГ и субстратом для ß-галактозидазы. Нетрансформированные клетки не могут расти в присутствии ампициллина, а клетки, несущие интактную плазмиду, образуют на среде с ампициллином колонии синего цвета. Клетки-хозяева, несущие гибридную, т.е. рекомбинантную, плазмиду, образуют на той же самой среде белые колонии. Это связано с тем, что обычно при встраивании в полилинкер чужеродной ДНК не может образовываться полноценный продукт гена lacZ', и, следовательно, в процессе α-комплементации не образуется активная ß-галактозидаза, расщепляющая субстрат X-Gal до продукта, который и обеспечивает окрашивание клеток колоний в синий цвет.