- •Векторные системы теория
- •1. Принципы и понятия технологии рекомбинантных молекул. Основные открытия молекулярной биологии, обосновавшие возможность конструирования рекомбинантных молекул.
- •2. Матричные процессы. Репликон и типы репликации днк. Стабильность наследования генетических структур.
- •3. Механизмы реализации генетической информации.
- •4. Молекулярное клонирование как способ исследования структурной организации генетических элементов и систем экспрессии чужеродной генетической информации.
- •5. Понятие вектора. Характеристика основных генетических элементов про- и эукариотических клеток, претендующих на роль векторов.
- •6. Общие свойства клонирующих векторов. Принципы клонирования днк in vivo и in vitro.
- •7. Рестрикционные нуклеазы и их характеристика.
- •8. Способы объединения фрагментов днк. Днк-лигазы. Днк-полимераза
- •12. Концевая трансфераза и ее применение при создании рекомбинантных молекул.
- •13. Векторные молекулы днк. Развитие представлений о векторных молекулах.
- •14. Введение молекул днк в клетки.
- •15. Требования к клеткам-хозяевам рекомбинантных молекул.
- •16. Структурно-генетическая организация полового фактора.
- •17. Плазмиды бактерий и их общие свойства.
- •18. Сегрегационная и структурная нестабильность плазмид.
- •19. Классификация плазмид.
- •20. Плазмиды бактериоциногенности и векторы на их основе.
- •21. Плазмиды лекарственной устойчивости бактерий.
- •22. Конструирование и структура «искусственных» векторов (плазмиды pRsf2124 и рМв9).
- •23. Принцип модульной организации плазмид.
- •24. Мигрирующие элементы и конструирование векторов для клонирования хромосомных генов бактерий in vivo.
- •25. Трансдуцирующие бактериофаги.
- •26. Организация генома бактериофага лямбда.
- •27. Общая и генерализованная трансдукция.
- •28. Характеристики pBr322, ее преимущества и недостатки.
- •29. Векторы на основе репликонов бактериальной плазмиды puc18, puc19.
- •30. Свойства бактериофага лямбда как универсальной системы для клонирования in vivo и in vitro.
- •31. Молекулярные векторы на основе генома бактериофага лямбда.
- •32. Космиды.
- •33. Фазмиды.
- •34. Искусственные хромосомы (рас, вас, yac)
- •35. Конструирование библиотек и клонотек.
- •36. Нитевидные фаги в качестве клонирующих векторов.
- •37. Конструкция и использование векторов на основе нитевидных фагов.
- •38. Векторы, предназначенные для изучения регуляции экспрессии генов.
- •39. Векторы для Bacillus.
- •40. Проблемы плазмидных векторов.
- •41. Челночные векторы.
- •42. Генетическая организация дрожжей.
- •43. Внехромосомные элементы сахаромицетов.
- •44. Введение днк в дрожжевые клетки.
- •45. Векторы для дрожжевых клеток. Требования к вектору.
- •46. Селективные маркеры дрожжей. Принципы клонирования.
- •47. Введение молекул днк в клетки млекопитающих.
- •48. Организация генома вируса sv40. Векторы на основе вируса sv40.
- •49. Основные проблемы при конструировании векторов млекопитающих.
- •50. Векторы для клонирования в растениях.
- •51. Молекулярная биология Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens.
- •52. Структура т-днк. Использование Ti-плазмиды в качестве векторов для создания трансгенных растений.
- •53. Бинарные системы.
- •54. Вирусы как векторы для растений.
27. Общая и генерализованная трансдукция.
Ответ. Процесс введения рекомбинантной фаговой ДНК со встроенным фрагментом чужеродной генетической информации в клетки-реципиенты основан на естественном природном явлении – трансдукции фаговой ДНК. Трансдукция (лат. transduction – перемещение) представляет собой процесс переноса бактериальной ДНК из одной клетки в другую бактериофагом. Таким образом, трансформация бактериальных клеток с помощью рекомбинантных ДНК на основе фаговой ДНК не требует специальной подготовки клеток-реципиентов или какого-либо специального приборного оснащения. Трансдукция основана на том, что в процессе размножения фагов в бактериях могут образовываться фаговые частицы, которые наряду с фаговой ДНК или вместо нее содержат фрагменты бактериальной ДНК. Такие фаговые частицы называются трансдуцирующими. По морфологии и адсорбционным свойствам они ничем не отличаются от обычных фаговых вирионов, но при заражении ими новых клеток передают генетические детерминанты предыдущего хозяина. В соответствии с этим принято выделять два типа трансдукции: генерализованную (неспецифическую, или общую); специфическую, или ограниченную. В осуществлении генерализованной трансдукции бактериальный вирус является только переносчиком генетического материала бактерий. При специфической трансдукции вирус включает ДНК бактерий в свой геном и передает ее, лизогенизируя бактерии-реципиенты. Генерализованная трансдукция осуществляется дефектными частицами фагов. Образование таких частиц происходит в ходе репродукции фагов, сопровождающейся распадом бактериальной хромосомной ДНК. Фаговые частицы, несущие фрагменты ДНК бактерий, называются дефектными или трансдуцирующими. Если полученным фаголизатом, содержащим как нормальные, так и дефектные частицы, обработать клетки штамма-реципиента, то заражение их нормальным фагом ведет, как правило, к лизису клеток. Однако некоторые клетки инфицируют дефектные трансдуцирующие фаги. В клетки поступают короткие фрагменты двунитевой ДНК донора. Циркуляризации бактериальной ДНК при этом не происходит, рекомбинируют с ДНК реципиента линейные фрагменты ДНК донора. Рекомбинация, происходящая при общей трансдукции, находится под контролем recA-гена, это общая гомологичная рекомбинация, осуществляемая путем реципрокного обмена соответствующими гомологичными участками. Возникают рекомбинанты, называемые трансдуктантами. Трансдуктанты нелизогенны и не обладают иммунитетом к фагам, так как трансдуцирующие частицы, вызвавшие их образование, не содержат фаговой ДНК. Однако при генерализованной трансдукции могут возникать не только истинные рекомбинанты-трансдуктанты, в которых привнесенный ген наследуется стабильно из поколения в поколение (полная, или завершенная, трансдукция), но и абортивные трансдуктанты. При абортивной, или незавершенной, трансдукции внесенный дефектным фагом фрагмент бактериальной хромосомной ДНК донора не рекомбинирует с хромосомной ДНК реципиентной клетки. Находясь в реципиентной клетке, привнесенный ген экспрессируется, что придает клетке новый фенотип, например способность к синтезу какой-то аминокислоты. Однако ген экзогеноты (привнесенный ген) не способен реплицироваться. Вследствие этого при делении клетки он передается только одной из дочерних особей, но во второй клетке сохраняется белок – продукт экспрессии привнесенного гена, и эта клетка в известной степени сохраняет приобретенный фенотип. Специфическая трансдукция была открыта в 1956 г. М. Морзе и супругами Е. и Дж. Ледерберг. Характерной особенностью специфической трансдукции является то, что каждый трансдуцирующий фаг передает только определенную, весьма ограниченную область бактериальной хромосомы. Если в генерализованной трансдукции фаг выступает в качестве «пассивного» переносчика генетического материала бактерий, то при специфической трансдукции фаг не только переносит генетический материал, но и обеспечивает его включение в бактериальную хромосому. Наиболее известным примером специфической трансдукции является трансдукция, осуществляемая фагом λ, который способен заражать клетки бактерий E. coli с последующей интеграцией его ДНК в геном бактерий. Умеренный фаг λ при лизогенизации бактерий в результате сайт-специфической рекомбинации (разрыв и перекрестное воссоединение цепей ДНК) встраивается в их хромосому только в одном месте: на участке между локусами bio и gal. Этот участок получил название attλ. Вырезание (эксцизия) профага из хромосомы при индукции профага осуществляется также по механизму сайт-специфической рекомбинации. Сайт-специфическая рекомбинация происходит точно, но не безошибочно. Между профагом и бактериальной хромосомой осуществляется генетический обмен. Встраивающийся в геном фага бактериальный генетический материал может заместить до 1/3 генетического материала фага. После упаковки фаговой ДНК, часть которой замещена бактериальной, в фаговую головку образуются дефектные фаговые частицы. Фаг является дефектным вследствие того, что объем головки ограничен и при включении в его геном фрагмента бактериальной ДНК часть фагового генома остается в хромосоме бактерий. Если дефект несущественен, то фаг сохраняет жизнеспособность, так как его белковая оболочка остается неповрежденной и обеспечивает адсорбцию на клетках. Такой дефектный фаг может заражать другие клетки, но не может вызывать репродуктивную инфекцию. Если в таком дефектном фаге в ДНК сохранились липкие концы, обеспечивающие превращение ее в циркулярную форму, то ДНК дефектного фага вместе с фрагментом бактериальной ДНК может интегрироваться в ДНК реципиентных бактерий и вызывать их лизогенизацию. Было установлено, что при индукции профага чаще образуются дефектные частицы, содержащие гены локуса gal. Такие дефектные частицы обозначают λdgal. Если в геноме фага содержится ген, ответственный за синтез биотина, то – λdbio. Следовательно, если фаголизатом, полученным после заражения донорных бактерий фагом, в котором содержится дефектные частицы, обработать реципиентные клетки bio– или gal–, то с частотой 10–5–10–6 образуются трансдуктанты bio+ или gal+.