43. Внехромосомные элементы сахаромицетов.

Ответ. При создании систем экспрессии рекомбинантных генов на основе дрожжей в настоящее время используются четыре типа векторов, которые различаются по способу, которым они обеспечивают существование чужеродной ДНК в дрожжевых клетках. Векторы первого типа, к которым относятся, в частности, векторы на основе дрожжевой интегрирующейся плазмиды Yip, используются для встраивания рекомбинантной ДНК в хромосомы дрожжей. У этих векторов отсутствует область начала репликации и они не способны самовоспроизводиться в трансформированных клетках. Поэтому единственным способом сохранения их последовательностей в клетках дрожжей является совместная репликация в составе хромосом. Второй тип векторов принадлежит к семейству дрожжевых реплицирующихся плазмид YRp. Эти плазмиды способны к автономной репликации в клетках дрожжей благодаря наличию у них ARS-последовательностей, о которых уже упоминалось в связи с искусственными хромосомами дрожжей (YAC). ARS-последовательности, по-видимому, представляют собой области начала репликации на хромосомах дрожжей. Векторы третьего шипа образуют так называемое семейство дрожжевых центромерных плазмид YCp, которые, как и следует из их обозначения, содержат в своем составе цетромер-ные последовательности хромосом дрожжей и обладают способностью не только к автономной репликации, но и более стабильному существованию в клетках дрожжей в виде внехромосомных элементов по сравнению с векторами предыдущего семейства. Наконец, векторы семейства дрожжевых эписомных плазмид YEp получены из природной многокопийной кольцевой плазмиды дрожжей (2 fim), и объединяют в себе большинство положительных качеств вышеупомянутых векторов. Они существуют в клетках дрожжей во внехромосомном состоянии в большом числе копий, автономно реплицируются и стабильно сегрегируют между делящимися клетками. Все перечисленные векторы являются челночными, т.е. допускают проведение этапов субклонирования фрагментов ДНК и наработки их в большом количестве с использованием клеток Е. coli. Это становится возможным благодаря наличию у них области начала репликации плазмиды pBR322, а также селектируемых маркеров, придающих бактериальным клеткам устойчивость к ампициллину и тетрациклину, соответственно. Селективный характер роста клеток дрожжей при наличии у них векторных молекул также обеспечивают селектируемые маркеры векторных плазмид. К ним относятся гены, дающие возможность деления ауксотрофных штаммов дрожжей на средах без соответствующих пищевых добавок: URA3, LEY2, HIS3, TRP1 или LYS2, которые восстанавливают способность ауксотрофов синтезировать, соответственно, урацил, а также аминокислоты Leu, His, Тгр или Lys. Эффективную транскрипцию рекомбинантных генов в клетках дрожжей обеспечивают специфические регуляторные элементы, промоторы и терминаторы транскрипции. Высокий уровень синтеза РНК на клонированных последовательностях в клетках S. cerevisiae может иметь место при использовании промоторных участков генов гликолиза: GAL4, ADH, PGK или GAPDH. При этом для исключения отрицательного влияния рекомбинантных белков на дрожжевые клетки промоторы должны быть индуцируемыми. Фрагменты ДНК, выполняющие роль терминаторов транскрипции часто берут начало от 3’-концевых последовательностей генов PGK, РН05 или TRP1. При этом последовательности 3’-концевых нетранслируемых участков генов могут оказывать большое влияние на эффективность транскрипции и трансляции клонированных рекомбинантных последовательностей.