15. Требования к клеткам-хозяевам рекомбинантных молекул.

Ответ. Использование бактерий как хозяев для рекомбинантной ДНК требует выполнения ряда условий. Организм клеток хозяина должен иметь генотип, соответствующий эффективной репликации вектора. Оптимальными характеристиками хозяина являются: быстрый рост на недорогих средах, отсутствие патогенности, способность принять чужеродную ДНК и поддержание ее стабильности при культивировании. Бесспорным лидером при выборе штамма-хозяина являются бактерии E. coli. Выбор определяют фундаментальные знания генетики и биохимии этих микроорганизмов, секвенирована полная последовательность генома этих бактерий, для них разработаны и успешно применяются генно-инженерные методы. Недостатком является потенциальная опасность, связанная с условной патогенностью E. coli, средой обитания которых является кишечный тракт человека. Даже непатогенные штаммы E. coli продуцируют эндотоксины, которые контаминируют выделяемые ими продукты, включая лечебные препараты (инсулин, гормон роста человека). Кроме того, секретируемые белки выделяются в периплазму и это обстоятельство затрудняет очистку, т.к. разрушение клеток ведет к дополнительной контаминации конечных продуктов. Основные достоинства B. subtilis в том, что они не патогенны и секретируют белки в среду. Тем не менее технология клонирования для них не развита так совершенно, как для E. coli. Другим ограничение является нестабильность бациллярных плазмид. Итак, в зависимости от характеристики клеток-хозяев и величины клонированных фрагментов ДНК выбирают вектор-носитель.

16. Структурно-генетическая организация полового фактора.

Ответ. Половой фактор бактерий (фактор фертильности, F-фактор) – генетическая структура бактериальной клетки-донора, ответственная за ее способность конъюгировать с бактериальной клеткой-реципиентом, не содержащей полового фактора, и передавать этой клетке свой генетический материал (ДНК). Было установлено, что F-фактор существует в бактериальной клетке в двух альтернативных состояниях по отношению к хромосоме: либо в автономном, либо в интегрированном. На этом основании фактор фертильности был отнесен к категории генетических структур, называемых эписомами или плазмидами, и получил название «F-эписома» или «F-плазмида». По своей хим. природе F-эписома представляет собой сверхскрученную спираль двухцепочечной ДНК, ковалентными связями замкнутую в кольцо. Молекула такой ДНК имеет длину 30,8–31,7 нм и мол. массу 62*10⁶–64*10⁶. В ДНК полового фактора бактерий различают несколько генетических функц, областей. Наиболее изученной из них является tra-область (англ. transfer перенос), контролирующая способность бактерии-донора к конъюгации и обеспечивающая передачу генетического материала (F-фактора либо хромосомных генов) клетке-реципиенту. На генетическую карту tra-области нанесен 21 структурный ген, входящий в эту область. Эти гены контролируют синтез F-ворсинок (так наз. половых ворсинок) клетки-донора, необходимых для осуществления ее конъюгации с клеткой-реципиентом, а также синтез ферментов, участвующих в метаболизме ДНК в процессе конъюгации. Эти гены составляют одну структурно-функциональную единицу – tra-оперон, обладающую автономной системой генетической регуляции. В состав этого оперона входит также ген tra S, определяющий неспособность содержащих половой фактор бактерий клеток-доноров быть реципиентами генетического материала при скрещивании их с бактериями, несущими аналогичный половой фактор бактерий. Однако это ограничение может преодолеваться при получении F – фенокопий клеток-доноров под влиянием некоторых воздействий (напр., выращивания бактериальных клеток при повышенной температуре, в условиях голодания и т. п.). Другая генетическая область F-эписомы контролирует его способность к автономной репликации в цитоплазме бактериальной клетки. Этот процесс также определяется хромосомными системами генетической регуляции, обеспечивающими относительно стабильное содержание полового фактора в бактериальной клетке (1–2 копии на одну хромосому). Автономная репликация F-фактора может быть нарушена при действии на клетку красителей акридинового ряда, некоторых поверхностно-активных веществ и лекарственных средств и т. д., что приводит к элиминации (потере) его у части клеток донорского штамма. Автономный (внехромосомный) половой фактор бактерий способен (правда, с низкой частотой) включаться в определенные участки бактериальной хромосомы благодаря наличию в его ДНК нуклеотидных последовательностей, гомологичных нуклеотидным последовательностям этих участков хромосом. В результате такого включения F-фактор становится частью хромосомного репликона, что приводит к образованию клеток-доноров типа Hfr, способных эффективно передавать реципиенту хромосомные гены. В клетках Hfr в то же время возможна рекомбинация между гомологичными участками интегрированного полового фактора бактерий и бактериальной хромосомы. В результате F-фактор возвращается в цитоплазму и переходит в автономное состояние, включив в свою структуру более или менее значительный прилежащий участок (или участки) бактериальной хромосомы. Таким образом возникают замещенные половые факторы бактерий (так наз. F'-факторы), несущие разнообразные по величине и генетической структуре участки ДНК хромосомы. Передача клетке-реципиенту включенных в половой фактор бактерий хромосомных генов (F-дукция, секс-дукция) происходит с относительно высокой частотой, значительно превышающей частоту передачи других хромосомных генов. При исследовании молекулярно-генетической организации и функций, особенностей F-фактора широко используются методы генетического анализа соответствующих бактерий-доноров, а также современные физико-химические, радиобиологические, электронно-микроскопические и другие методы изучения ДНК. Способность F-фактора клеток Е. coli К12 обеспечивать эффективную передачу генетического материала в реципиентные клетки используют в генетике бактерий при составлении генетических карт организмов этого вида. В результате скрещиваний F-эписому удалось передать из клеток Е. coli К12 в бактерии различных видов и родов, что позволило для некоторых из них сконструировать штаммы Hfr-доноров и составить генетические карты, в т. ч. для патогенных бактерий родов Salmonella, Shigella и др. Помимо авирулентного штамма Е. coli К12 оригинальные F-факторы со свойствами эписом были обнаружены у отдельных штаммов условно-патогенных Е. coli, а также у некоторых патогенных бактерий (роды Pseudomonas, Vibrio и др.) в результате чего появились новые возможности для генетического анализа детерминант патогенных и антигенных свойств бактерий. Удобной моделью для такого анализа могут служить также разнообразные замещенные половые факторы бактерий, в структуре которых содержатся отдельные фрагменты ДНК (группы генов) бактериальной хромосомы. Имеются экспериментальные данные о способности F-фактора обеспечивать внутривидовой, межвидовой и межродовой конъюгационный перенос детерминант различных свойств бактерий (в т. ч. патогенных свойств и антигенных признаков, лекарственной устойчивости, метаболической активности и др.), которые позволяют предполагать, что генетический обмен играет существенную роль в эволюции естественных популяций патогенных и условно-патогенных бактерий, в развитии инфекционных и эпидемических процессов.