22. Конструирование и структура «искусственных» векторов (плазмиды pRsf2124 и рМв9).

Ответ. pMB8 – размер плазмиды – 2.6 тыс. п.н. Эта плазмида стала основой для разработки целой серии клонирующих векторов. Плазмида несет ген иммунности к колицину – придает клетке устойчивость к его летальным дозам (кодируя белок иммунности); плазмида имеет единственный сайт узнавания для EcoRI. Для отбора гибридных клонов бактерии высевают на чашки Петри со средой, содержащей колицин E1. Плазмида pMB9 была сконструирована на путем гибридизации pMB8 и pSC101 – таким образом, в pMB9 был перенесен ген устойчивости к тетрациклину. Обе плазмиды были обработаны EcoRI и затем сшиты ДНК-лигазой, с последующим отбором трансформантов с фенотипом TcrColimm. Плазмида имеет размер 5.3 Кб и имеет места действия для четырех рестриктаз: EcoRI, HindIII, BamHI, SalI. При встройке чужеродной ДНК в местах узнавания 3-х последних рестриктаз нарушается ген устойчивости к тетрациклину. При встройке по EcoRI-сайту фенотипическую селекцию производить не удается. pRSF2124 – плазмида размером 11,1 Kb, полученная в результате транслокации in vivo транспозона Tn3, несущего ген устойчивости к ампициллину, из плазмиды RI в плазмиду ColE1. Отбор гибридных клонов происходит по их устойчивости к ампициллину (маркер Apr). Единственное место узнавания рестриктазой EcoRI находится внутри гена синтеза колицина, и при встройке чужДНК по этому месту, клетка демонстрирует иммунитет к колицину, но отсутствие способности к его синтезу. Плазмида pRSF2124 была получена в лаборатории С. Фалькова в результате транслокации in vivo транспозона Tni, несущего ген устойчивости к ампициллину, из плазмиды RI в ColEl. Эта плазмида сохраняет тип репликации родительской плазмиды ColEl. Отбор клеток, содержащих плазмиду pRSF2124, не представляет трудностей, так как она обусловливает легко детектируемую устойчивость к ампициллину. Единственное место узнавания рестриктазы ЕсоШ находится внутри гена синтеза колицина, и при встройке фрагментов ДНК по этому месту плазмида детерминирует устойчивость клетки-хозяина к ампициллину, иммунитет к колицину и отсутствие способности к синтезу колицина. Наличие дополнительного селектируемого маркера (Арг) в плазмиде pRSF2124 делает ее более удобным вектором по сравнению с ColEl, так как упрощает отбор клонов клеток, содержащих гибридные плазмиды. К недостаткам этой плазмиды следует отнести довольно большой размер (11,1 тпн) и возможность клонирования фрагментов ДНК только по месту расщепления рестриктазой ЕсоШ.

23. Принцип модульной организации плазмид.

Ответ. Существует много разных принципов классификации плазмид. Особого внимания заслуживает принцип, основанный на учете наличия в них модульных сегментов ДНК. В таблице суммированы данные о модульных особенностях пяти природных плазмид. Каждый модульный сегмент может содержать один или несколько генов, или цис-действующих элементов, таких, например, как область инициации репликации.

Каждая плазмида должна иметь один или несколько модулей репликации, которые позволяют ей автономно реплицироваться. Некоторые плазмиды содержат также многие другие модули, кодирующие, например, системы рестрикции-модификации (система Eco RT). Модули как подвижные элементы. Плазмиды, выделенные независимо и даже в организмах, обитающих в разных местах планеты, часто содержат близкородственные модули. На основании этих и других данных возникло представление о том, что между геномами происходит обмен некоторыми генетическими модулями в виде интактных сегментов ДНК. В настоящее время доказано, что в бактериальных плазмидах происходит множество перестроек и обменов. Например, плазмиды, присутствующие в клетках определенных бактерий, отличных от Е. coli, особенно в Salmonella typhimurium или Proteus mirabilis, могут диссоциировать на две отдельные плазмиды, каждая из которых содержит одну из двух ее частей. F-подобные последовательности образуют независимо реплицирующуюся конъюгативную плазмиду, обозначаемую RTF, а остальная часть – другую реплицирующуюся, но неконъюгативную плазмиду, обозначаемую Г. Поскольку как RTF, так и Г – независимые репликоны, каждая из них должна содержать модуль ДНК, обеспечивающий репликацию. Подобные перестройки не являются лабораторным курьезом: RTF- и Г-плазмиды обнаружены и в природе. Эти и другие данные, полученные при изучении генетики бактерий, привели к идентификации дискретных подвижных элементов, названных инсерционными последовательностями и транспозонами, которые способны перемещаться не только между плазмидами, но и между плазмидными и клеточными геномами. Многие модули в плазмидах обычно являются подвижными элементами или фланкированы ими.