38. Векторы, предназначенные для изучения регуляции экспрессии генов.

Ответ. Структурные особенности вектора, необходимые для успешной экспрессии вводимого гена: кодирующая последовательность чужеродного гена непрерывна; ген находится под контролем промотора, который узнается РНК-полимеразой E. Coli. Промотор – участок ДНК, который инициирует транскрипцию гена. Находится на смысловой цепи рядом с геном. Промотор организует сайт прикрепления РНК-полимеразы и специальных белков – факторов транскрипции. Направление цепи «по течению» (downstream) – от 5' к 3'-концу, «против течения» (upstream) – от 3' к 5’ концу. мРНК, считываемая с гена, правильно транслируется белок-синтезирующим аппаратом E. coli. Экспрессирующие векторы E. coli делятся на 2 основные группы: обеспечивающие экспрессию целевого полипептида в составе химерного белка; обеспечивающие экспрессию индивидуального целевого белка. Особенности экспрессии клонированных эукариотических генов в клетках E. coli. Универсальность генетического кода подразумевает, что в прокариотической клетке возможна транскрипция и трансляция любой последовательности, при условии сигналов инициации и терминации транскрипции и трансляции, правильно узнаваемых прокариотической клеткой. Так как большинство эукариотических генов раздроблены, они не могут быть в своем первичном виде экспрессированы в прокариотических клетках, где отсутствует система сплайсинга. Для преодоления данного препятствия используют зрелые матричные РНК, выделенные из эукариотических клеток, на основе которых с помощью обратной транскриптазы синтезируют комплиментарные цепи ДНК (кДНК), а затем на них достраивают комплиментарную цепь, получая двухцепочечные ДНК-копии мРНК. Такие фрагменты ДНК можно встраивать в подходящий вектор. Гибридные гены – у которых кодирующая последовательность – эукариотическая, а сигналы инициации и терминации транскрипции и трансляции – бактериальные. Векторы, обеспечивающие экспрессию целевого полипептида в составе химерного белка. Клонируемый ген вводится в данные векторы так, чтобы регуляторная область бактериального гена оставалась неизменной, а встройка происходила в его структурной части. При совпадении рамки трансляции бактериального гена с рамкой трансляции встроенного гена синтезируется химерный (гибридный) белок, обладающий частью иммунохимических характеристик целевого чужеродного белка. Целевой белок получается пристыкованным c N-конца к бактериальному полипептиду-носителю. Химерные белки используют как вакцины для иммунизации с целью выработки антител (антитела вырабатываются в том числе на целевой белок, несмотря на его гибридную природу). Например, в качестве полипептида-носителя берут бета-галактозидазу E. coli. N-конец полипептида – аминный конец, принятый за начало полипептида, несет NH2-группу. Биосинтез белка на рибосоме начинается с N-конца. Однако в ряде случаев рамки трансляции бактериального и встраиваемого генов не совпадают. Тогда клонируемая последовательность будет транслироваться неправильно. Чтобы преодолеть эту трудность, создается набор из 3-х векторов со встроенными короткими синтетическими фрагментами разной длины, обеспечивающих сдвиг рамки трансляции. Один из вариантов обязательно обеспечит правильную трансляцию. Экспрессирующие вектора этой серии называются pPC – φ. Практическое значение создания химерных белков. Химерные белки применяются в иммунологии – для иммунизации животных и затем использования их как биофабрик антител. Например, чужеродный белок создается как гибрид в составе фермента бела-галактозидазы E. coli. При этом важно сохранить большую часть бета-галактозидазы в неповрежденном виде, чтобы обеспечить специфичность хроматографической очистки химерного белка. Химерный белок на основе бела-галактозидазы при введении кроликам обеспечивает наработку в организме животного антител как на бела-галактозидазу, так и на целевой белок. Векторы, обеспечивающие экспрессию индивидуального целевого белка. Такие векторы используются для создания штаммов E. coli-продуцентов чужеродных белков (в том числе белков животных и человека), синтезирующих белок без добавления к нему каких-либо посторонних полипептидов. Пример такого вектора – плазмида pAS, обеспечивающий эффективную, строго регулируемую транскрипцию встроенной последовательности, и может направлять синтез индивидуального чужеродного белка. Этот вектор содержит сильный фаговый промотор PL, инициирующий транскрипцию чужеродного белка. Для обеспечения строгой регуляции транскрипции, следом за ним встроен терминатор транскрипции из фага лямбда – tR1. Транскрипция, инициируемая с PL, может преодолевать данный терминатор только при наличие в клетках E. coli белка-антитерминатора N фага лямбда. таким образом, инициируя образование в клетке белка N, можно «выключить» данный терминатор. Вслед за терминатором в векторе встроен участок связывания рибосом (SD-ATG). Участок узнавания рестриктазой BamHI расположен так, что данный фермент расщепляет плазмиду сразу за инициаторным ATG-триплетом. Это позволяет точно подстраивать белок-кодирующие последовательности под рамку считывания (обычно с помощью синтетических сегментов ДНК). После чужеродной вставки имеется еще один терминатор транскрипции. Его роль – поддерживать стабильность гибридной плазмиды в клетках бактерии, т.к. в его отсутствие интенсивная транскрипция с PL может подавить репликацию плазмиды с участка ori. Сильный промотор: Хотя промоторные области имеют консенсусную последовательность, которая является наиболее распространенной последовательностью в этом положении, некоторые гены имеют «сильные» промоторы, которые хорошо связываются с аппаратом транскрипции, а другие имеют «слабые» промоторы, которые связываются плохо. Эти слабые промоторы обычно допускают более низкую скорость транскрипции, чем сильные промоторы, потому что с ними связывается аппарат транскрипции и реже инициирует транскрипцию. Векторы E. coli, детерминирующие экспрессию и секрецию чужеродного белка. Синтез белка с последующей его секрецией (т.е. выделенгие из клетки в среду культивирования) очень важен для промышленной биотехнологии, т.к. это снимает необходимость выделять белок из клеток и удешевляет производственный процесс. Секреция белка у E. coli – это пока мало изученная область биологии. К сожалению, секреция белков в окружающую среду у этой бактерии происходит крайне редко. Секреция белков из цитоплазмы происходит в: внешнюю и внутреннюю мембраны, а также в периплазматическое пространство. В результате около 25% белка клетки содержится в этих трех элементах клетки. Установлено, что секреция белка во внешнюю среду у грамотрицательных бактерий происходит через белок-предшественник, часть (домен) которого образует транспортный канал, а потом отделяется от секретируемой части. Столь сложная организация пре-белка пока затрудняет создание векторов для экспрессии белков с их последующей секрецией вовне. Тем не менее, создан вектор pIN-III-ompA, обеспечивающий секрецию собственных белков E. coli, а также гормона роста человека и интерферона человека в периплазму E. coli. Для успешной секреции в периплазму необходимо добавление к основному полипептиду сигнального пептида (домена), или N-концевого лидера, который затем отщепляется после прохождения основного полипептида через плазматическую мембрану. Вектор экспрессии-экскреции pEAP8 в векторной системе E. coli был создан в 1986 г. Он содержит ген kil, ответсвенный за выход колицина в окружающую среду. Продукт гена kil, белок Kil делает внешнюю мембрану проницаемой для белков периплазматического пространства. Этот вектор содержит селективный маркер устойчивости к хлорамфениколу – Cmr, промотор, участок связывания рибосом, ген kil и ген-эквивалент сигнального пептида (для прохождения через плазмалемму). Показано, что такой вектор обеспечивает экспрессию и экскрецию наружу клеток гормона роста человека hGH.